蛋白质相互作用技术研究的几种技术ppt课件

.,蛋白质相互作用研究技术,汇报人:布沙热木.阿布力孜玛伊热.努热艾合买提夏尤普.玉苏甫阿布力米提.莫明,.,酵母双杂交谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pulldown）免疫共沉淀双分子荧光互补技术(BIFC)生物发光共振能量转移（）技术,常用蛋白质相互作用的研究技术,.,一、细菌双杂交系统,Two-hybridsystem是90年代初发展起来的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（targetprotein）相互作用的基因。基本原理：真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的,如GAL4（酵母转录激活蛋白Gal4的基因）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。,.,酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(BD)，C端：113个氨基酸组成的转录激活域(AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。,.,.,BD,A,COOH,AD,B,NH2,COOH,共转化,+,BD,A,AD,Gal4,Gal4,Promoter,Reporter,NH2,Gal4,Gal4,B,.,酵母双杂交基本过程,举例,.,二、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pulldown）原理,GST-融合蛋白,GST,X,Y,谷胱甘肽-琼脂糖球珠,细胞裂解物,tube,4下孵育2h,GST,X,Y,+,.,GSTpulldown实验流程,（1）Glutathione琼脂糖珠预处理。（2）GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10l已经处理过的beads置于1.5ml离心管中，4,摇床孵育过夜。（3）孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。（4）将菌体用溶菌酶处理，之后破碎细菌壁，最大转速4离心20min,收集上清液。（5）将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4，摇床3h。（6）3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。（7）加15l2SDS上样缓冲液，煮沸5min.（8）SDS-PAGE,WesternBlot或质谱仪分析。,.,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarosebeads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。,三、免疫共沉淀原理,.,三、免疫共沉淀原理,.,免疫共沉淀实验流程,（1）将菌体用溶菌酶处理，冰上裂解30min,之后破碎细菌壁，最大转速4离心30min,收集上清液。冰上裂解30min,（2）取少量裂解液以备Westernblot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细菌裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜。（3）取10lproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min。（4）将预处理过的10lproteinA琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连。（5）免疫沉淀反应后，在4C以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次。最后加入15l的2SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟。（6）SDS-PAGE,Westernblotting或质谱仪分析.,.,四、双分子荧光互补技术(bimolecularfluorescencecomplementation,BIFC),BiFC技术是将荧光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，对研究蛋白质相互作用有重要意义。,.,.,BIFC的优势,在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用的蛋白发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。,.,五、生物发光共振能量转移（）技术,技术是近年来出现的一种新的检测蛋白质蛋白质相互作用的技术。是建立在非辐射能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体发光酶（lux）和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白G）之间会发生能量转移。供体发光酶在相应底物存在时发射光波。能量受体是荧光蛋白，在一定波长范围内吸收光波，并在一定的波长范围内发射光波。将两个目的蛋白分别和供体和受体形成融合蛋白，两个目的蛋白之间距离足够近并发生相互作用，即可检测到信号。,.,.,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的