第五章基因的克隆与分离.ppt

第五章基因的克隆与分离,第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA第二节基因组文库的构建与基因分离第三节cDNA文库的构建与筛选第四节根据差异表达获得目的基因第五节基因的化学合成,一、cDNA末端的快速扩增（RACE）,RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆。（RACE克隆的意义）,第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA,1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3端和5端的扩增。3、拼接成cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。,第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA,一、cDNA末端的快速扩增（RACE）,（二）经典RACE克隆原理：3RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3末端序列。5RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列，利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列。,5RACE,在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列,用oligo（dT）引发合成cDNA第一链,利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列,第二节基因组文库的构建与基因分离,基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。,一、基因组文库（genomiclibrary）,（2）目前常用的载体,二、构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列：容量为23kpcosmid载体：容量为45kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb,1、文库的完整性：文库应包含基因组的完整序列信息2、基因组信息的可重建性：重建基因组的完整信息3、文库的大小：即文库中应包含的独立重组子数目,三、基因组文库应满足的条件,文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-P),ln(1-L/G),P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,L：克隆fragment的平均大小,G：Genome大小,N：所需的重组载体数（克隆数）,N=,4.61,G,L,例如：人的基因组是3109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104bp，所需的重组载体数：,N=,基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或3倍，或更高,四、基因组文库构建的一般步骤,2、大片段的制备,小孔喷射（10kb）、超声波（300bp）、机械搅拌（8kb）,酶切法：,不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。识别4对碱基的内切酶适用于制备120kb的DNA片段,物理切割法：,1、染色体DNA的分离,如：Sau3A与BamHI的酶切末端。p108,3、载体的制备,内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段,左臂,可置换区,右臂,SalIBamHIEcoRI,EcoRIBamHISalI,20kb,14kb,9kb,4、重组连接,左臂,插入片段,右臂,左臂,插入片段,插入片段,右臂,5、包装,6、重组噬菌体感染大肠杆菌,基因组文库,五、基因组文库的筛选,筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来,探针筛选法：两步或三步原位杂交法,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,cDNAlibrary,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。,第三节cDNA文库的构建与筛选,（1）以mRNA为材料，适用于RNA病毒（2）文库小，构建容易，筛选简单（3）每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列（4）不含内含子序列，可进行原核表达,一、cDNA文库的特点,cDNA文库应满足的条件：文库的代表性：文库中重组cDNA分子是否可以完整的反映来源细胞中的表达信息，用库容量衡量。序列的完整性：5UTR（容易丢失）、编码区、3UTR,p117,二、构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（totalRNA）提取,Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。,（2）mRNA的分离纯化,分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。,反转录酶,（3）cDNA的合成,cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,OligodT引物,用RNaseH识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物,降解mRNA模板,RNaseH,mRNA,mRNA,mRNA,cDNA第二链合成,mRNA小片断为引物，合成第二链cDNA。,DNAPolI除去引物并修补后，再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。,mRNA,cDNA第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA聚合酶,DNA聚合酶,cDNA第二链,cDNA第一链,3,5,DNAligase,去引物,在双链cDNA末端接上人工接头（含限制性内切酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,（4）cDNA与载体连接,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,（5）重组载体转化受体菌,分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,三、文库的查询（screening）,基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。,Genomiclibrary与cDNAlibrary区别,一、cDNA末端的快速扩增（RACE）,根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆。（RACE克隆的意义）,上节内容回顾,（二）经典RACE克隆原理：,（一）RACE：,5RACE,在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列,用oligo（dT）引发合成cDNA第一链,利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列,二、基因组文库的构建与基因分离,基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。,（一）基因组文库（genomiclibrary）,（二）基因组文库应满足的条件,1、文库的完整性2、基因组信息的可重建性3、文库的大小,（三）基因组文库构建的一般步骤,（四）基因组文库的筛选,筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来,探针筛选法：两步或三步原位杂交法,（一）cDNAlibrary,将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。,三、cDNA文库的构建与筛选,（二）cDNA文库应满足的条件,1、文库的代表性2、序列的完整性,（三）构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（totalRNA）提取,（2）mRNA的分离纯化,（3）cDNA的合成,（4）cDNA与载体连接,（5）重组载体转化受体菌,基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。,Genomiclibrary与cDNAlibrary区别,第四节基因差异表达获得目的基因,在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。真核基因总数约为100000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15000种不同的mRNA分子。,一、差异显示PCR（DDRT-PCR）,DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术,（1）3锚定引物,Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M：A、GorCN:A、G、TorC,5,3,利用mRNA的polyA尾巴设计,利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增,12种锚定引物,3,这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示。使用这种锚定引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。,（2）5端的随机引物,同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5端又设计了20种10bp长的随机引物。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二链，并PCR,（3）用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增,12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。,引物组合：,实验结果：,如果每条带相当于一种mRNA，20000mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。,在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。,240组能分出20000多条带！,（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较,相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳,选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。,优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等；缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短。,1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。,第五节基因的化学合成,一、化学合成目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法、,自动化合成法。,1、互补延伸连接法,二、化学合成DNA片断的组装,预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。,3,5,引物,（3）T4DNA连接酶连接,T4多核苷酸激酶,完整的DNA双链,2、互补连接法,（合成的DNA单链的5端是-OH）,（2）5端磷酸化,（1）互补配对,预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。,1.直接合成基因,2.合成引物（20mer左右）,（1）mRNA的含量很低，很难操作cDNA,3.合成探针序列,4.定点突变合成,合成带有定