Caco-2 细胞模型的研究与应用

.,Caco-2细胞模型的研究与应用,Seminar,.,主要内容,Caco-2细胞的介绍Caco-2细胞模型的建立与评价Caco-2细胞模型的应用Caco-2细胞模型的发展,.,Caco2细胞单层模型简介,aco-2细胞：人结肠癌细胞（thehumancoloncarcinomacellline)Caco-2细胞的形态学特征：Caco-2细胞具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接。,.,Caco-2细胞生化性质特征：主动转运系统:糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B12内源性因子的主动转运载体。酶:小肠细胞刷状缘的酶；相代谢酶:CYP1A1相代谢酶:谷胱甘肽S-转移酶,-葡萄糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶。由于形态学及生化性质都与小肠上皮很相似,Caco-2细胞模型已广泛的用于体外药物分子肠吸收的研究。,Caco2细胞单层模型简介,.,Caco2细胞单层模型建立,aco-2细胞模型的建立,.,Caco-2细胞模型的平面图,Caco-2细胞模型的切面图,.,Caco2细胞单层模型的评价,细胞形态学(小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接);小肠刷状缘细胞标志酶碱性磷酸酶的活性;Caco2细胞单层的跨膜电阻(transepithelialelectricalresistance,TEER);漏出标志物(甘露醇、荧光黄等)被动扩散的跨膜通量;Caco2细胞的胞饮功能(用辣根过氧化物酶测定);,.,药物肠道吸收的方式被动扩散穿细胞间载体转运胞吞外排系统（如P-gp、MRP）,药物吸收,.,Caco2细胞单层模型的药物转运机理,药物的转运过程:药物分子从Caco-2单细胞层的顶侧肠腔侧(AP侧)跨过Caco-2单细胞层或经由细胞间隙到达基底侧(BL侧),Caco-2单层细胞模型示意图AP侧:肠腔侧;BL侧:基底侧,.,Caco2细胞单层模型药物吸收实验参数,Papp=dQ(dtAC0),Papp：表观渗透系数dQ/dt：接受药物侧待测药物出现的速率，即渗透速率A：细胞单层表面积（cm2)C0:给药侧的初始药物,.,细胞培养条件:细胞种植密度是否达到融合,细胞分化的阶段,重要营养物质或生长因子的存在或缺失。转运介质的组成溶液的浓度、温度、pH值等。某种代谢来源的能量或离子的存在或缺失,竞争性溶质的在或缺失。,影响细胞转运和代谢性质的因素,.,Caco2细胞单层模型在药物吸收研究中的应用,研究药物结构-吸收转运关系1预测药物的体内吸收:被动扩散药物的口服生物利用度与表观渗透系数间有良好的相关关系2,3。Tab1Relationshipbetweenapparentpermeabilitycoefficients(Papp)andBioavailability研究药物剂型对吸收的影响4确定药物在肠腔吸收的最适pH值5评价前体药物的口服吸收6,.,Caco2细胞单层模型在药物吸收机制研究中的应用,Caco-2细胞模型用于被动转运的研究7Caco-2细胞模型用于载体介导主动转运的研究8、9Caco-2细胞模型用于药物外排机制的研究10,.,Caco-2细胞模型在中药吸收研究方面的应用,Caco-2细胞模型在中药吸收方面研究的热点目前主要集中在对黄酮类化合物及生物碱吸收机制的研究。对黄酮类化合物中的槲皮素4-葡萄糖苷在进行研究发现,该化合物在Caco-2细胞模型中不被吸收。外排呈饱和过程,这一外排过程不能被P-gp抑制剂维拉帕米抑制,但却能被MRP抑制剂MK571竞争性抑制。这一结果说明槲皮素4-葡萄糖苷在Caco-2细胞模型中的外排是由MRP介导的,同时服用MRP抑制剂对提高该化合物的口服吸收程度可能有帮助11。,.,Caco-2细胞模型在药物代谢方面的应用,I相代谢酶:细胞色素P450等。相代谢酶:磺基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶、-葡糖醛酸糖苷酶。存在P-gp、MRP外排系统及细胞色素P450同工酶(与人类小肠上皮一致),人们可以利用这一模型研究氧化代谢与外排作用在限制药物口服生物利用度方面的关系12。,.,Caco2细胞单层模型的优点,细胞培养条件相对容易控制,能够简便、快速的获得大量新的、有价值的信息,这些信息易于转化为药物转运、代谢的基本原理。Caco-2细胞来源是人结肠癌细胞,同源性好。该模型与药物在肠中的吸收有良好的相关性、较高的重现性。该模型有较广泛的适用性(可用于原料药、制剂、大、小分子的跨肠膜研究)。Caco-2细胞内有药物代谢酶,可在有代谢状况下测定药物的跨膜转运。可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。,.,Caco2细胞单层模型的缺点,Caco2细胞由于缺乏分泌粘液的杯状细胞,因而缺乏小肠上皮中的粘液层。缺少细胞异质性(单一细胞构成);Caco2细胞中某些特别的酶(细胞色素P450的一些同工酶)的活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gp在Caco-2细胞中表达的波动性对结果有不同程度的影响。Caco2细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具特征性,其TEER值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分子药物穿细胞间转运的应用研究。Caco2细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低,因而在主动转运药物的研究方面相对不如被动扩散药物研究的成功。,.,Caco2细胞单层模型的新发展,优化细胞培养条件：缩短细胞培养的时间。细胞共培养：如与杯状细胞HT29共同培养,为Caco-2细胞单层膜提供其缺乏的粘层膜。生化诱导：用经典的细胞生物学方法诱导Caco2细胞上缺乏或低表达的药物代谢相关酶和转运体的表达。重组技术：Charles13等用重组技术在Caco2细胞中引入CYPcDNAs,提高CYP3A4和CYP2A6的表达。通过培养CYP3A4表达的Caco2细胞,开拓Caco2模型在研究药物首过代谢方面的应用。,.,1GanLS,ThankkerDR.ApplicationsoftheCaco-2modelinthedesignanddevelopmentofbiochemicalandphysicalbarriersposedbytheintestinalepithelium.AdvDrugDeliveryRev,1997;23(13):77982ArturssonP,KarlssonJ.Correlationbetweenoraldrugabsorptioninhumanandapparentdrugpermeabilitycoefficientsinhumanintestinalepithelial(Caco22)cells.BiochemBiophysResCommun,1991;175(3):88053YeeS.InvitropermeabilityacrossCaco22cells(colonic)canpredictinvivo(smallintestinal)absorptioninman2factormyth.PharmRes,1997;14(6):76364UdataC,PatelJ,PalDetal.Enhancedtransportofanovelanti-HIVagent2cosalaneanditscongenersacrosshumanintestinalepithelial(Caco22)cellmonolayers.IntJPharm,2003;250(1):1576855YamashitaS,FurubayashiT,KataokaMetal.OptimizedconditionsforpredictionofintestinaldrugpermeabilityusingCaco-2cells.EurJPharmSci,2000;10(3):1952046RouquayrolM,GaucherB,RocheDetal.TransepithelialtransportofprodrugsoftheHIVproteaseinhibitorssaquinavir,indinavir,andnelfinaviracrossCaco-2cellmonolayers.PharmRes,2002;19(11):170412,参考文献,.,7GanLS,HsyuPH,PritchardJF,ThakkerD.Mechanismofintestinalabsorptionofranitidineandondansetron:TransportacrossCaco-2cellmonolayers.PharmRes,1993;10(12):1722-58MenonRM,BarrWH.TransportersinvolvedinapicalandbasolateraluptakeofceftibutenintoCaco22cells.BiopharmDrugDispos,2002;23(8):317-269AnandBS,PatelJ,MitraAK.Interactionsofthedipeptideesterprodrugsofacyclovirwiththeintestinaloligopeptidetransporter:Competitiveinhibitionofglycylsarcosinetransportinhumanintestinalcellline2Caco22.JPharmacolExpTher,2003;304(2):781-10FrickerG,DreweJ,HuwylerJetal.RelevanceofpglycoproteinfortheenteralabsorptionofcyclosporinA:Invitro2invivocorrelation.BrJPharmacol,1996;118(7):1841-711WalgrenRA,KarnakyKJ,LindenmayerGE,WalleT.Effluxofdietaryflavonoidquercetin422glucosideacrosshumanintestinalCaco-2cellmonolayersbyapicalmultidrugresistance2associatedprotein22.JPharmacolExpTher,2000;294(3):830-612王堃,仲来福.肠道CYP3A和P-gp:服药物的吸收屏障.中国药理学通报,2003