Westerblot 试验操作步骤.doc

Westerblot 试验操作步骤一、 蛋白样品制备WIP组织细胞裂解液（塞池）取出WIP裂解液，待融化后颠倒混匀数次，适量分装冻存。在使用前取出PMSF（100mM），按比例加入（使其最终浓度为1mM）混匀，立即使用。取Ep管，分别称重标记，把组织剪成小块装入Ep管中，称重。按每20毫克组织家100100微升的比例加入WIP（如裂解不完全，可以适当增加WIP的用量；如需要的蛋白样品浓度较高，可以适当减少WIP的用量）。用手握式电动组织细胞匀浆器匀浆约1分钟或直至充分裂解。10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。如果组织样品本本身非常细小，如淋巴细胞，可直接加入WIP裂解液，通过震荡（vortex）以使样品裂解完全。注意事项：(1) 为获得最佳的实验效果，可适当分装使用，以尽量避免反复动融。(2) PMSF应现用现加(3) 裂解蛋白的所有步骤都需在冰上或4进行。(4) 蛋白酶抑制剂均有较高的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，一旦直接接触，请立即用流水冲洗，再向医疗保健结构咨询。二、蛋白浓度测定：采用BCA法。（WIP裂解液中含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法进行蛋白定量。）三、SDS-PAGE的配制：分离胶12%，浓缩胶5%1 试剂及配制：（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g；去离子水至100ml；过滤，避光，4贮存1个月。（有毒）（2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：Tris碱18.15g80ml去离子水浓盐酸调节PH至8.8去离子水至100ml；4贮存。（3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）Tris碱12.1g80ml去离子水浓盐酸调节PH至8.8去离子水至100ml；4贮存。（4）10%SDS:10g SDS100ml去离子水；室温贮存。（5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵1ml水。4可保存1周，最好用前现配。（6）TEMED（7）分离胶、浓缩胶液配方：12%分离胶5%浓缩胶10%分离胶5ml10ml2ml4ml5ml10ml水(ml)1.63.31.42.72.04.030%丙烯酰胺(ml)2.04.00.330.671.73.31.5mmol/L Tris溶液(pH8.8)(ml)1.32.51.32.51.0mmol/L Tris溶液(pH6.8)(ml)0.250.510%SDS(ml)0.050.10.020.040.050.110%过硫酸铵溶液(ml)（催凝剂）0.050.10.020.040.050.1TEMED(ml)0.0020.0040.0020.0040.0020.0042. 制胶程序：（小分子量）（1） 装板（2） 配制分离胶（按5ml/胶的量混合）；加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约1cm，约需4ml/胶）（3） 立即在顶层加入几毫升覆盖液（凝胶浓度8%用0.1%SDS; 10%用正丁醇；也可用去离子水；动作要轻，尽量避免覆盖液稀释分离胶顶部）。（4） 聚合完成后（约15min），倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能洗干凝胶顶端的残存液体。用力把水甩干。（5） 配制浓缩胶（每块胶的用量是2ml），插入梳子，避免混入气泡，垂直放置于室温下聚合。（6） 在浓缩胶聚合后，拔出梳子，用去离子水冲洗梳孔，直接电泳或放4冰箱备用（注意：勿使胶干燥，可用保鲜膜包裹）。（7） 分离胶、浓缩胶的配方Tricine-甘油 SDS-PAGE分离胶夹层胶浓缩胶16.5% 4.5 ml10% 2 ml4% 2 ml49.5% T 3% C/0.407 ml0.160 ml49.5% T 6% C1.50 ml/凝胶缓冲液1.4 ml0.623 ml0.463 ml4.5SDS 0.1ml0.044 ml0.033 ml甘油0.48 ml/ddH2O1.02 ml0.926 ml1.344 ml10AP40 l20 l20 lTEMED5 l3 l3 l（先制备分离胶，聚合后，再制备夹层胶，最后制备浓缩胶，分离胶2.5ml，夹层胶0.7ml，浓缩胶1.25ml。）四、电泳：1 试剂：（1）上样缓冲液（5）：上样Buffer用时稀释5倍（即用时取1ml+4ml去离子水）（2）电泳缓冲液（5）：试剂用量用量甘氨酸47g94 gTris碱7.55g15.1 gSDS2.5g5g水500ml1000 ml（3）预染蛋白分子量Marker2 电泳程序：（1）样品与加样缓冲液混匀（稀释成1，100 35min，充分变性）（2）将凝胶放入电泳槽中，加入1电泳缓冲液（内加150ml加满，用新配的；外加350ml，可重复用23次）（3）按次序上样，注意加蛋白分子量标准，每个上样孔分别装入1025g总蛋白。（两边上样Buffer，Marker，样品，样品加完后剩余的样孔都上样Buffer。）（4）电泳（恒压）开始时电压8V/cm凝胶（80100V），约15min燃料进入分离胶后，增加到15V/cm凝胶（180V）电泳到染料抵达分离胶底部时断电，约35min（开始电压30 V，电泳1 h左右，当染料进入夹层胶后电压增至100 V，直至结束。）（5）取下凝胶固定染色或进行Western blot分析。（切Marker端右上角做标记，并切除浓缩胶部分）五、转膜：1 试剂：（1） 转移缓冲液：试剂终浓度每1000ml用量每2000ml用量甘氨酸39mM14.413g28.826 gTris碱48mM3.0285g6.057 g无水甲醇20%200ml400 ml水至1000至2000(2) 丽春红染液：储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。2 转膜程序：（1） 戴手套，剪4张滤纸，和一张PVDF膜，大小与凝胶相同。（或比凝胶小12mm、绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而互相接触），以防转膜时发生短路。）在膜的一角（左上角靠近Marker处）做一记号（或剪角）。（2） 取3个培养皿，将剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）去离子水（5min）转移缓冲液（大于10min）。（3） 滤纸和海绵（纤维）垫浸入转移缓冲液中（大于10min）（4） 剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。（5） 安装转膜装置：从正极（红色）负极（黑色）依次为：白色边盒多孔垫片（12张）滤纸PVDF膜凝胶（12张）滤纸多孔垫片黑色边盒。扣上吊扣后插进转膜槽中。转膜槽内两侧加冰盒。防止电泳时过热。（黑色对黑色）（注意多孔垫片黑色在下，蛋白面向黑色负极）（6）接通电源（凝胶一边接负极，PVDF膜一边接正极）：恒流电转移两个小时，电流为：膜面积（cm2）2mA。（注：20kDa/h/cm2/mA;67kDa蛋白，大约2mA/cm2/cm2/2h）（一般都是100mA）（7）电泳结束后，关闭电源，将膜取出，置塑料盒或培养皿中用丽春红S染色（约5min），确定转移效率。回收丽春红S，然后用蒸馏水洗去背景燃料显色，室温稍干燥后观察蛋白带所在位置，然后用TBST浸泡几次，然后洗去丽春红S染料。（转膜至0.22 m PVDF膜（Ployvinylidine Difluoride），100 mA转膜1 h。）六、封闭和免疫反应：1 试剂：（1） TBS试剂终浓度1000ml用量2000ml用量For GFPTris-HCl20mmol/L2.42g4.84g12.1gNaCl140mmol/L8.18g16.32g40g去离子水至1000ml至2000至5000mlPH 7.5PH 7.6（2） TBST：TBS+0.05%Tween-20试剂终浓度100ml用量500ml用量For GFPTween-200.05%0.05ml0.25 ml0.1%(v/v)TBS100ml500ml上述for GFP TBS（3） Dry Milk （脱脂奶粉）：（4） Blocking buffer：TBST+5% Dry Milk试剂终浓度20ml用量100ml用量Dry Milk5%1g5 gTBST20ml100ml（5） 抗体用Blocking buffer 稀释。（二）、免疫反应程序：1. 取膜，放入10ml Blocking buffer（封闭缓冲液），室温轻摇2h，或4过夜。2. 一抗孵育，用封闭液配制，1:1000，室温摇床上孵育1h后4过夜。（或室温摇床上孵育1.5h）3. 用TBST室温洗膜10min3次4. 二抗孵育。用封闭液稀释，1:2000，室温轻摇45min。5. 用TBST洗膜10min3次七、ECL显影：1 试剂（1） 超敏发光液（2） 显影液（3） 定影液2 显影程序（1） 发光液工作液的配制：等体积混合适量A液和B液，室温放置备用，易在临检测前配制；（直接在保鲜膜上混合）（2） 显色反应：二抗孵育后，并进行数次洗涤后，用平头镊将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体（切勿接触膜的蛋白面），然后置于保鲜膜上，浸入并与发光液均匀充分地接触，孵育5min。（3） 取膜，弃发光液，用吸水纸吸去过多的液体。用保鲜膜包裹，去除气泡和皱褶，滤纸吸去多余发光液。（4） 压片检测：将膜固定于暗盒内（蛋白面朝上）。暗盒内放入胶片，压片曝光。（压片时间要摸索）（5） 显影：胶片放入显影液，观察显影情况。（