蛋白质高效液相色谱技术

.,高效液相色谱法在蛋白质分离中的应用,陈檬S1030624张双健S1030621郭传龙S1030622石晨阳S1030623汪菊芬S1030625,.,5,.,HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。,特点,.,根据分离机理蛋白质HPLC又可分为,1,2,4,3,高效凝胶过滤色谱(HPSEC),高效离子交换色谱（HPIEC）,高效亲和色谱（HPAFC）,反向高效液相色谱（RP-HPLC）,.,高效液相色谱仪,.,常用的HPLC仪,Waters公司Agilent公司岛津公司等,.,一进样系统,.,六通阀进样,高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。,上样,分析,.,进样阀,样品,装样,废液,淋洗液,至分离柱,定量环进样,（）,（）,样品环,.,进样方式,进样量应不大于定量环体积的50%（最多75），并要求每次进样体积准确、相同。缺点是易产生由进样引起的峰展宽,进样量应不小于定量环体积的510倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性,.,二输液系统,.,高压输液泵,输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。,流量稳定流量范围宽输出压力高液缸容积小密封性能好，耐腐蚀,.,流量不受柱阻影响,泵压可达400kg/cm2,输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服,.,三分离系统,.,色谱柱,柱效高选择性好分析速度快,.,进入色谱柱样品的处理,.,柱的使用和维护注意事项,色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。应逐渐改变溶剂的组成。一般说来色谱柱不能反冲，会迅速降低柱效。,.,选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。,柱的使用和维护注意事项,.,四检测系统,.,.,UV检测器,.,数据处理和计算机控制系统,恒温装置,在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在0.10.5之间，检测器的恒温要求则更高。,采集处理分析数据,控制仪器,色谱系统优化,.,流动相的要求,反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙腈。一般情况下甲醇-水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙腈-水做初始实验，与甲醇比，乙腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185-205nm处检测的要求。,.,流动相的准备,调整PH,根据所分离蛋白质及色谱柱决定,流动相脱气,滤膜过滤,目前实验室主要用的是超声15min左右,溶剂使用前都必须经0.45m滤膜过滤，以除去杂质微粒。分清有机相滤膜和水相滤膜，对于混合流动相，在混合前过滤,.,蛋白样品的性质,.,HPLC与其他色谱光谱技术的联用,CE,MS,CE,HPLC,.,高效液相色谱质谱蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测。,高效液相色谱毛细管电泳当毛细管电泳与HPLC联用时，两者各自优势都得以发挥。HPLCCE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离,.,反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定,应用实例,色谱柱,流动相,梯度洗脱,其他,C5柱(100mm*4.6mm5m，Ph-enomenex公司，美国,A相:10mmol/LTris缓冲液(pH8.5);B相:乙腈;流速:1mL/min,B相体积分数变化为:015min,15%25.5%;1521min,25.5%。,进样量20L柱温25,.,.,高效液相色谱目前多用于蛋白质的定量分析，对于大样品的分离纯化成本较高且费时，有待进一步优化其