基因工程的基本操作程序最新

.,基因工程的基本操作程序,.,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,二、基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,.,基因的种类,（1）编码蛋白质的基因（2）没有转译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。,.,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,例子：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,也可以是一些具有调控作用的因子,.,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？如何构建基因文库？为什么要构建基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,.,概念：基因文库（genelibrary）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary),.,基因组文库:基因组文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.如cDNA文库,.,基因组文库与部分基因文库的关系,.,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,a.直接分离法(鸟枪法),如何构建基因文库？,.,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,b.反转录法：cDNA的合成流程图解,如何构建基因文库？,.,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,.,为什么要构建基因文库？目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。,.,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,条件：_、_、_、_.,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种游离脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,一段已知目的基因的核苷酸序列（前提）,（2）利用PCR技术扩增目的基因,模板,.,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成。,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,.,变性（90-95）,PCR技术扩增目的基因的过程：,.,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,.,（3）人工合成,也可以根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成（DNA合成仪）,.,2.下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、CDNA文库法D、聚合酶链反应,.,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,1、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代同时使目的基因能够表达和发挥作用。,.,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,.,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,.,3.目的基因与运载体结合所需的条件有同一种限制酶具有抗性基因的质粒RNA聚合酶目的基因DNA连接酶四种脱氧核苷酸ATPABCD,4.（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因B启动子C终止子D标记基因,ABCD,D,.,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,.,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,.,过程：,优点：经济、有效,.,（2）基因枪法（3）花粉管通道法,.,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射带目的基因受精卵新性状动物,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,.,3、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,.,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,.,四目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,.,(一）检测,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,1.检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法：,DNA分子杂交技术,变性,变性,.,变性,方法：,分子杂交技术,2.检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。,.,提取,3.检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法：抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,.,（二）鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,.,1基因工程的正确操作步骤是()构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求获取目的基因ABCD,2.下列有关基因工程技术的叙述，正确的是()A重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和基因进入受体细胞的载体B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C选用细菌作为重组质粒的受体细胞主要是因为细菌繁殖快、遗传物质少D只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达,巩固训练,.,3、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，最主要的原因是A结构简单、操作方便B繁殖速度快C遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少4、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌枯草杆菌支原体动植物细胞ABCD,B,D,5、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达,C,.,6.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养ABCD,C