流式细胞仪分析技术及应用PPT课件

.,第十一章流式细胞术,.,主要内容,.,流式细胞术（flowcytometry，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光光学、计算机、电子物理学、流体力学、细胞化学和免疫学等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等,4,第一节流式细胞术的分析及分选原理,光学系统,测试原理,流式细胞仪,电子系统,液流系统,光学原理,光电转换原理,.,激光,光电倍增管,放大电路,流式细胞仪是集多种技术为一体的新型高科技仪器,激光技术单克隆抗体技术细胞荧光化学技术光电测量技术电子物理技术电子计算机技术,能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选,.,一、流式细胞仪分析的工作原理,荧光显微镜技术,单克隆抗体与荧光染料技术,计算机技术处理光信号,激发光源改为激光,提高检测灵敏度和特异性,提高检测速度和统计分析精确性,.,（一）流式细胞仪基本结构,包括流动室（flowchamber）和液流驱动系统作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且在特定的时间内，应该只有一个细胞或生物微粒通过激光束。,液流系统,.,流动室和液流驱动系统,.,流动室仪器的核心部件，待测样品与激光在这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等制成。流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动室喷嘴口，形成细胞液柱。,.,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,.,液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器等。常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行流速是不变的。,.,包括激发光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管。流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。,光学系统,.,光学系统,.,采用高压汞灯，廉价、激发光谱广泛，但在单一谱线上能量较弱，且功率不够稳定，应用受到一定限制,弧光灯,提供单波长、高能量、高稳定性的光照，是快速、准确分析细胞微弱光的理想光源。现代流式细胞仪多采用激光,激光,激发光源,.,光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的探测器,1）长通滤片（longpassfilter，LP)2）短通滤片（shortpassfilter，SP)3）带通滤片（bandpassfilter，BP）,.,长通滤片,只允许特定波长以上的光通过，如LP500滤片，只允许500nm以上的光通过,短通滤片,与长通滤片正好相反，只允许特定波长以下的光通过，如SP500滤片，只允许500nm以下的光通过,带通滤片,只允许相当窄波长范围内的光通过，滤片一般有两个值，如BP500/50允许通过的波长范围为475525nm，中心值为500nm。,.,组成：光电转换器、放大器和信号处理电路作用：将产生的各种光信号成比例的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。,电子系统,.,高度聚焦激光束,（二）基本工作原理,单细胞悬液,特异性荧光染料标记抗体染色,流动室,检测区,恒定气压,鞘液喷出,细胞单行排列,特异性荧光,+散射光,.,入射光束与液柱垂直方向,前向小角方向,荧光信号,侧向散射光信号,前向散射光信号,荧光检测系统,散射光检测系统,前向散射光感受器,光信号,光信号,电信号,计算机系统,转换,放大,.,.,二、细胞分选原理,（一）分选的基本原理,流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定的细胞的依据。分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应用最多的是电荷式分选。,.,当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱被分割成一连串均匀的液滴。根据设定的被分选细胞的某个参数由逻辑电路判断是否被分选。,电荷式分选1,.,充电电路对选定细胞液滴充电，使其带正电荷或负电荷，未被设定分选参数的细胞液滴则不带电荷。带电细胞液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中，其他液体则被当作废液抽吸掉，完成细胞分选的目的。,电荷式分选2,.,（二）FCM分选技术要求,细胞分选对仪器的性能要求较高分选是流式细胞仪的重要功能之一分选功能的装置较为复杂,分选指标,分选速度,分选纯度,分选收获率,.,每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度至少达5000个/秒左右。,被分选出的细胞所占百分比，分选纯度与仪器配置和细胞是否重叠有关。,被分选出来的细胞占应被分选的细胞的比例。通常情况下，分选纯度和收获率是相互矛盾。,.,488nm激光,-,前向散射光检测器,荧光检测器,电磁场,单个细胞被分类进入检测管,流式细胞仪分选系统,.,第二节数据的显示与分析,一、参数,1、散射光信号：分为前向散射光（forwardscatter，FSC）和侧向散射光（sidescatter，SSC）。散射光不依赖于任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数，反映的是细胞的大小的内部结构。2、荧光信号,.,二、散射光的测定,前向散射光检测器,侧向散射光检测器,在激光束的正前方，又称小角散射FSC信号的强弱与细胞的体积大小成正比，检测的是细胞或其他颗粒的表面属性,在激光束的垂直方向，又称90散射SSC信号的强弱与细胞内颗粒结构的质量成正比，用于检测细胞内部结构属性,.,.,.,三、荧光测量,当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。,.,（一）荧光信号测量与放大器线性放大器：输入与输出放大倍数相同，用于信号强度变化较小或具有生物学线性的信号对数放大器：输入放大10倍，输出由1变为2，用于信号强度变化较大且其光谱信号较复杂的信号（二）荧光补偿消除重叠信号,.,四、数据显示方式,X轴代表一维参数（荧光或散射光信号强度），以通道(channel)表示，其与光强度之间的关系（线性或对数）依放大器的性质而定，通道右侧信号的光强度明显高于左侧，越靠右侧光亮度越强。,（一）单参数直方图,.,Y轴代表颗粒计数（Count），反映相同荧光或散射光强度的颗粒相对数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。,单参数分析只能表达具有相同特性细胞数量与光信号强度的关系，对复杂表型分析时单参数分析结果的准确性会受到诸多因素的干扰。,.,双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，X轴与Y轴分别代表一种参数。双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示法是用点密图来显示。如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到两个单参数直方图。临床实践中常以多个散点图联合分析。,（二）双参数直方图,.,点图由二维参数构成，根据颗粒密度来反映相同光信号的颗粒数量的多少,1、点图,2、二维等高图,等高图(contourplot)是一种可以同时表达两个检测参数和细胞频度的方式，其本质也是双参数直方图,.,X轴反映SSC的信号强弱Y轴反映FSC的信号强弱,X轴反映FITC荧光信号强弱Y轴反映PE荧光信号强弱,点图,.,把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多，越密集的区域也就是细胞数目变化最快的区间。,等间距等高线适用于细胞数目变化不大的情况对数间距等高线适用于细胞数目变化较大的情况,二维等高图,.,三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难,（三）三参数直方图,.,FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计出多种数据。,（四）多参数组合分析,.,指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。,指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定要分析的特定细胞群，并要求该样本的所有其他参数组合的直方图只体现该群细胞的分布情况。,.,Region设置,Gate设置,.,五、流式细胞术的特点,速度快,对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞,灵敏度高,每个细胞上只需带有10003000个荧光分子即能检测出来,多参数,多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征,精度高,在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高,纯度高,可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到99%以上,无害性,能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选,.,六、流式细胞术定量分析的注意事项,流式细胞仪的应用已从科研进入了临床，在进行科研和临床检验定量分析过程中，应明确各项工作环节的影响因素并对仪器性能进行严格的质量控制，以保证检测数据的准确性和可靠性。,.,确保标本上机检测前细胞浓度满足仪器检测要求。荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。必须根据具体实验目的设置必要的对照，确保实验结果的准确性和客观性，消除非特异性荧光的影响。判定结果时，应注意减去本底荧光，可应用计算机程序软件，使定量分析更精确。,注意事项,.,能否制备出合格的单细胞悬液是关系最终分析结果准确与否的关键。单细胞悬液大多来自生物样品，不同组织来源的样本制备方法也不同。,第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求,一、FCM单细胞标本的制备,.,流式细胞术主要是以某一类细胞群为检测对象，减少检测时的干扰因素。新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。,（一）外周血单细胞悬液制备,.,（二）培养细胞的单细胞悬液制备,悬浮生长,贴壁生长,反复吹打,分散细胞,常规洗涤,低速离心,蛋白酶消化,机械吹打,细胞脱落,低速离心,漂洗重悬,单细胞悬液,培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长。,.,将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。,（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备,.,该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。对石蜡切片的要求较严格。,（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备,.,活检标本及各种内镜取材标本也克制备成单细胞悬液。一般要求镜检取材标本至少取3块以上。制备方法与新鲜实体组织基本相同。,（五）活检标本单细胞悬液制备,.,脱落细胞应去除取材伴随的杂质后，再制备单细胞悬液。脱落细胞用流式细胞术检测，是一种更为客观的检测手段，对临床诊断和治疗很有意义。,（六）脱落细胞的单细胞悬液制备,.,FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的试剂。,二、FCM样品的荧光染色,.,直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。,（一）直接免疫荧光染色法,优点,操作简单，方法简便、快速特异性强，与其他抗原交叉染色较少反应中只有两种因素（细胞与抗体）参与，结果判断较简单,.,（二）间接免疫荧光染色法,已知未标记的特异性抗体（一抗）与待测抗原反应，再用荧光素标记的抗免疫球蛋白抗体（二抗）进行标记染色，通过对荧光素标记的二抗所发射的荧光信号进行检测，对标本中待测抗原进行鉴定。,.,优点,敏感性高具有更广的通用性,缺点,操作步骤繁琐，干扰因素较多易产生非特异性染色，结果判断有时比较困难,.,多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员的要求较高。试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。,（三）多参数分析时荧光抗体的组合标记,.,自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后所发出的荧光。每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在实际临床检验工作中应注意区别。,（四）自发荧光,.,（五）FCM常见荧光染料的种类和特性,尽可能高的光子产量，以提高信号强度,对激发光有较强的吸收，以降低背景噪音,激发光谱与发射光谱之间要有尽可能大的间隔，以减少背景信号对荧光信号的干扰,易于与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合，而不会影响被标记物的特性,理想荧光染料,.,常用的染料有以下几种：,异硫氰基荧光素（FITC）,藻红蛋白（PE）,别藻青蛋白（APC）,藻红蛋白偶联物PE-Cy5,得州红（Texasred）,藻红蛋白偶联物PE-Cy7,.,常用荧光染料的特性和应用,.,三、免疫胶乳颗粒技术的应用,液相芯片技术：利用胶乳颗粒的载体特性，结合荧光标记和FCM，实现对多种可溶性物质的分析。低样本量、多参数、更高检测效率,.,四、流式细胞仪的质量控制,（一）单细胞悬液制备的质量控制材料新鲜、防止细胞膜损伤溶血剂由于低渗液，严格掌握低渗时间机械法优于化学法或酶法，控制力度温度：25-37，PH7.0-7.2,.,（二）免疫荧光染色的质量控制,高温荧光淬灭的可能性增大对荧光染色结果影响显著，一般要求温度在20以下,温度,pH值改变则会造成荧光光谱改变，影响荧光强度,pH值,非特异性荧光强弱代表非特异性结合水平，不消除将使检测结果假性升高,非特异荧光,细胞浓度低、溶剂的性质等,固定剂与细胞的某些物质结合后，干扰了荧光染料与细胞成分的结合，造成荧光强度改变,固定剂,.,（三）仪器操作技术的质量控制,光路与流路校正PMT校准绝对计数的校准,.,（四）免疫检验的质量控制,在流式细胞术实验过程中，实验的每一个环节都会存在很多不稳定的因素，因此必须严格做好质量控制工作，从而保证实验的科学性和可靠性。,.,环境要求,一般要求环境温度在2025之间，实验室内尽量减少灰尘和烟尘，光源要有良好的屏蔽作用。,仪器校正,每天校正，定期进行光路和流路校准，还需进行不同仪器间和不同实验室间的比对。,样本要求,合格的单细胞悬液是分析成功的关键，保证待测标本新鲜，避免细胞损伤等。,1,2,3,.,设置对照,最重要的是设置同型对照和全程质控，将质控品与待测标本一起操作，以保证检测结果的准确性,数据的获取和分析,获取实验数据前，应先调节仪器；分析实验数据时，要根据实验目的来决定分析模型。,4,5,.,淋巴细胞亚群的检测已成为某些疾病诊断、疗效评价和免疫功能检测的常规手段。不同淋巴细胞亚群用普通光学显微镜、血细胞分析仪无法鉴别，其在分化成熟过程中表达的CD抗原特性也不同，利用流式细胞仪结合单克隆抗体技术能够准确分类计数淋巴细胞亚群。,第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用,一、淋巴细胞亚群分析,.,采用三色标记的单克隆荧光抗体，可对T细胞亚群进行分类。Th细胞表达CD3+CD4+CD8-Tc细胞表达CD3+CD4-CD8+,（一）T淋巴细胞及亚群分析,.,成熟B细胞主要表达CD19、CD20、CD21、CD22分子，同时检测CD25分子，可进一步观察B细胞活化状态。,（二）B淋巴细胞及亚群分析,（三）NK细胞分析,目前临床上常采用三色荧光抗体标记将CD3-CDl6+CD56+淋巴细胞定为自然杀伤细胞（Natutalkillercell，NK细胞）。,.,注：每个实验室宜建立本室的参考范围，不同人群、不同试剂、不同地区可能有差别,健康成年人外周血淋巴细胞亚群分析的参考区间,.,细胞介导细胞毒实验：淋巴细胞与靶细胞共培养，加入碘化丙啶（PI，渗透到死亡细胞致其染红色），细胞内细胞因子测定：同时测定多种CK,二、淋巴细胞功能分析,.,FCM在血液病诊断、治疗和预后判断方面，具有非常重要的价值。,三、白血病免疫表型分析,正确区别急性髓细胞性白血病（AML）和急性淋巴细胞性白血病（ALL）。正确鉴别AML中的M0、M6、M7型。正确诊断双系列型或双表型白血病。正确诊断少见、疑难白血病。发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病。,.,正常血细胞在分化发育成熟过程中，某些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的标记。白血病细胞可用造血细胞分化抗原类标记检测。FCM结合单克隆抗体的应用可以提高白血病分类诊断的符合率，是一种客观的检测手段。FCM对白血病复发的主要根源，微小残留病灶（MRD）的检测具有高敏感性和特异性，早期检出MRD避免疾病复发。,.,典型AML的免疫表型特点,.,获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的特征是CD4+T淋巴细胞数量和功能的进行性破坏,从而引起全身继发严重感染和癌变。FCM可以快速检测外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞相对数和绝对数的变化，同时也可以检测CD4+T细胞的功能变化。,四、艾滋病的诊断与治疗,.,FCM是当前血小板研究中不可缺少的检测工具，可用于检测血小板的多项指标。对血小板相关的多种疾病诊断、治疗和预防，以及抗血小板活化药物的研究、评价及治疗监测等方面具有重要意义和研究价值。血小板分析一般通过SSC和FSC散射光对数取样设门。,五、血小板分析,.,基本原理：用某种荧光染料与网织红细胞内的RNA结合，再通过流式细胞术检测被染色的网织红细胞数目。噻唑橙(thiazoleorange，TO)是目前用于FCM法分析网织红细胞最理想的一种染料。,六、网织红细胞分析,.,阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，PNH）是一种以补体介导的血管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病。PNH患者其红细胞、粒细胞、淋巴细胞表面的CD55、CD59抗原