竹叶黄酮提取工艺研究120203.doc

竹叶总黄酮提取工艺研究陈宇基金项目：莆田学院大学生创新项目，莆田学院大学生科研立项（10192）作者简介：陈宇（1980），女（汉），辽宁沈阳人，讲师，硕士，主要从事天然产物的提取分离与测试工作。E-mail: ，邓金木，林丽丽，吴慧龙，杨建建，钟红金（莆田学院环境与生命科学系 莆田 351100）摘 要：探讨用醇提法提取竹叶中黄酮类成分的最佳工艺，为竹叶的开发利用提供理论依据。以竹叶为试材，以乙醇为溶剂，采用分光光度法对竹叶中的黄酮类化合物的含量进行测试。通过单因素试验研究乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对总黄酮提取率的影响, 再采用正交试验法优化提取总黄酮的最佳工艺条件。单因素和正交试验表明：影响黄酮提取率的因素主次顺序是：料液比 乙醇浓度 提取时间 浸润时间。最佳实验条件为料液比120，60%的乙醇，60提取4小时，竹叶中黄酮的含量为7.88 mgg-1。关键词：竹叶 黄酮类化合物 正交试验中图分类号：S718.4竹子是禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，研究表明，竹叶中含有大量的黄酮类化合物1-2 和其他生物活性成分，如酚酸、蒽醌类化合物、活性多糖、香豆素类内醋、特种氨基酸等3-4，其中黄酮是其主要的生理活性成分5。生物类黄酮化合物具有清除自由基、抗衰老和预防心血管疾病等生理功能6-8。目前，对竹叶黄酮类物质功能作用的研究已成为一个热点，为此，本研究以莆田学院校园内的竹子叶片为材料，研究了竹叶黄酮提取工艺，并采用正交试验优化黄酮提取工艺，为竹子的综合开发利用提供参考。1 材料与方法 1.1材料1.1.1 原材料：竹叶（佛肚竹）采至芳名湖畔，经烘箱70烘干，再用研钵研碎，过60目筛备用。1.1.2 试剂：芦丁标准品（99%，郑州荔诺生物科技有限公司），氢氧化钠、三氯化铝、硝酸铝、亚硝酸钠、乙醇、石油醚等均为分析纯试剂。1.1.3主要仪器：BS224S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司、722型分光光度计 上海光谱仪器有限公司制造、DGH-9246电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司、RE52CS-2旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂、恒温水浴锅 国华电器有限公司。1.2 方法1.2.1标准曲线的绘制称取10 mg芦丁标准品，用30%乙醇标定在50 mL的容量瓶中，配成浓度为0.200 mgmL-1 的芦丁溶液再分别取0mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于25 mL的比色管中，在每个比色管中加入1 mL 5%的NaNO2充分振荡6分钟再加入1mL 5%的Al(NO3)3，振荡5min，再加入10 mL 10%的NaOH，再定容到刻度线，以试剂空白为参比液，于510nm处测其吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行回归，得C与A关系曲线的回归方程。1.2.2 提取及测定方法称取一定量干燥的竹叶颗粒，加入一定体积和一定浓度的溶剂，在一定温度下加热回流提取一定时间，过滤，滤渣用少量同浓度溶剂洗涤合并滤液，在用旋转蒸发仪出去多余的溶剂，将所得的浓缩液用石油醚萃取多次后，取下层溶液，定容至50mL，充分摇匀备用。分别从各组不同实验条件所得的定容样品溶液中移取1.00mL竹叶提取液至25mL量瓶中，加入蒸馏水定容，摇匀；加入5%的NaNO2溶液1mL充分振荡6分钟，再加入5%的Al(NO3)3溶液1.00mL，振荡5min，最后加入10%的NaOH溶液10mL。用蒸馏水定容至25.00mL，以试剂空白为参比，测吸光度。2 结果与分析2.1芦丁标准曲线按绘制曲线的方法，得出的实验结果如图1：芦丁浓度mgmL-1吸光度A图1 芦丁标准曲线由曲线得出其曲线方程为：A=10.1143C - 0.0096，相关系数R2为0.9968。22.2 提取时间的影响称取干燥的竹叶5份，在圆底烧瓶中加入120.00mL70%的乙醇溶剂，提取时间依次为1，2，3，4，5h，按照1.2.2的方法研究不同的提取时间对黄酮得率的影响，结果见图2。时间/h得率/%图2 黄酮得率随浸提时间的变化关系从图2可知，黄酮的提取率随着提取时间的增大逐渐升高，当浸提时间为3h时提取率最高，当时间超过3h之后，提取率开始下降，这可能是由于随着浸提时间的加长，黄酮物质在浸提剂中逐渐分解造成的。2.3 乙醇浓度对提取率的影响提取时间为3h，提取液分别为40%，50%，60%。70%，80%，90%的乙醇溶液，按1.2.2的方法用量，以试剂空白作为参比液，测吸光度，实验结果见图3。乙醇浓度得率/%图3 黄酮得率随乙醇浓度的变化关系从图3可以看出，随着乙醇浓度的升高，黄酮的提取率逐渐呈上升的趋势，当乙醇的浓度达到60%附近时黄酮的得率最高，之后随着乙醇浓度的增大，提取率反而呈现下降的趋势，这可能是由于部分黄酮是水溶性的，随着乙醇浓度的增大，水的含量变少，这样水溶性的部分不能充分溶解出来造成的。同时一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增加。根据“相似相溶原理”，黄酮类化合物的溶出度与溶剂的极性有关，极性相近可达到最大溶出度，乙醇的浓度为60%时提取效果较佳。2.4 料液比对提取率的影响按料液比分别是120，130，140，150，160不同比例提取3h，所得浸提液抽滤后旋转蒸发浓缩后稀释至相同的体积，按1.2.2的方法用量，以试剂空白作为参比液，测吸光度。料液比gmL-1得率%图4 黄酮得率随料液比的变化关系料液比的选择主要考虑：第一，加入的提取剂在量上要满足黄酮类物质能够充分溶解并转移到液相中，第二要保证获得较高浓度的提取液，这样可以减少后期浓缩时间，降低能耗成本，这就要求料液比尽可能的小。固定其他条件，考察料液比对总黄酮提取量的影响，结果如图4，随料液比增大，总黄酮提取量增大，160的料液比时提取率较低，可能是由于浸提液较多，旋转蒸发时间较长，造成黄酮类化合物损失一部分，而130和150的提取率相差不大，从成本的角度考虑料液比130更合适。2.5 提取温度对提取率的影响温度/得率%在50，60，70，80的温度下提取黄酮类化合物3h后，按1.2.2的方法用量，以试剂空白作为参比液，测吸光度。图5 黄酮得率随温度的变化关系从图5可知随着提取温度的升高黄酮的提取率呈上升趋势当提取温度达到70时提取率达到最大，这是由于随着温度的升高，分子运动较激烈，提取剂和目标产物的扩散速率加大，目标产物在提取剂中的溶解度增大，提取率增大，温度超过70之后提取率开始下降，分析其原因主要是由于提取温度过高造成黄酮类化合物部分分解而使得率降低。因此提取时温度选择70为宜。2.6提取工艺的优化在提取条件选择的单因素试验中，考察了浸提剂浓度、料液比、提取温度和提取时间四个因素对竹叶黄酮类物质提取率的影响，取四个因素中较优的三个水平来作对比，试验的因素水平和试验结果如表1，表2，方差分析见表3。表1 因素水平表水平(A)浸提剂浓度(B) 料液比(C)提取温度/(D)提取时间/h150%乙醇120602260%乙醇130703370%乙醇140804由表2中极差结果分析可知，RBRARCRD，即表示料液比对竹叶中黄酮的提取的影响最大，浸提液浓度、提取温度的影响次之，提取时间对黄酮的提取的影响最小。表2 实验方案及实验结果分析试验号列号黄酮含量mgg-1ABCD111117.74212226.16313336.81421237.79522316.95623127.32731327.33832137.28933217.10k16.907.627.457.26k27.356.807.026.94k37.247.087.037.29极差R0.450.820.430.35因素主次BACD优方案B1A2C1D3正交结果分析表明：竹叶中黄酮提取的最佳实验条件为B1A2C1D3，即料液比120，60%的乙醇，60提取4小时。由表3可见，考察因素在选取的水平范围内对黄酮提取率影响不显著。表3 方差分析表因素平方和自由度F比临界值显著性浸提剂浓度0.32721.391F0.99（2，2）=99.0-料液比1.05124.472F0.95（2，2）=19.0-提取温度0.35921.528F0.90（2，2）=9.00-提取时间0.23521.000-误差0.232 按照上述确定的最佳试验条件B1A2C1D3，重复进行3次试验，总黄酮的含量分别为7.92 mgg-1 、7.87 mgg-1、7.84 mgg-1，平均为7.88 mgg-1。3 讨论余文等9研究发现慈竹叶片黄酮含量达2.9584.863 mgg-1，杨萍等10研究表明小黄苦竹含总黄酮质量分数最高，为13.54 mg/g，短穗竹最低，为7.24 mgg-1。本文通过单因素实验和正交试验对竹叶中黄酮的提取工艺进行研究，结果表明：料液比对竹叶中黄酮的提取的影响最大，浸提液浓度、提取温度的影响次之，提取时间对黄酮的提取的影响最小。最佳提取工艺条件为料液比120，60%的乙醇，60提取4小时，过滤，用石油醚萃取除杂，定容，进行黄酮含量的测定，在此条件下，竹叶中黄酮的含量为7.88 mgg-1，与文献研究结果基本一致。目前，紫外分光光度法被认为是最常用的检测总黄酮的方法，具有灵敏度高、检出限低的特点。但由于醇提液中含有醇溶性的绿原酸、花青素、鞣酸及其他酚类成分，在测定波长也有很强吸收，因此对含量结果产生很大干扰，从而使测定结果偏高11。因此，该试验中采用络合紫外分光光度法来测定竹叶醇提液中的总黄酮含量，该法利用铝离子与黄酮形成络合物显色来提高对黄酮的测定灵敏度及专属性，从而能得到较合理的结果12- 13 。参考文献：1陆志科,谢碧霞.不同种竹叶的化学成分及其提取物抗菌活性的研究J.西北林学院学报,2005,20(1): 49-52.2邬建敏,贾之慎,唐云湖.竹类黄酮化合物总量及芦丁含量的测定J.浙江农业大学学报,1998,24(4): 425-428.3唐莉莉,徐榕榕,丁霄霖.竹叶多糖对小鼠移植瘤的抑制作用J.无锡轻工大学学报, 1998,17(3): 62-65.4张英.天然功能性添加剂-竹叶提取物J .精细与专用化学品,2002,(7):20-22.5张凌云.竹叶黄酮的研究与应用进展J.现代食品科技,2006,22(2):247-236.6张英.竹叶黄酮的生理与药理活性J.世界竹藤通讯,2004,2(2):1211.7许宝泉,吴水英,宋秋华.竹叶黄酮的生理功能研究进展J.江西林业科技,2006,(1): 37-39.8张英,吴晓琴,俞卓裕.竹叶和银杏叶总黄酮含量及其抗自由基活性的比较研究J.中国中药杂志,2002, 27(4): 254-257.9余文, 胡尚连, 卢学琴, 等. 慈竹叶片黄酮的提取工艺及在四川不同地区含量的差异J. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2008, 36(7): 143-148.10杨萍, 钱俊青, 胡永萍.苦竹类竹种总黄酮提取工艺的比较J. 浙江林学院学报, 2005 , 22 (1) : 24-27.11胡庭坤，何俊瑜. 杜仲叶中总黄酮的提取工艺研究J安徽农业科学, 2010, 38(13) : 6712- 6713.12 尉芹, 王冬梅, 马希汉, 等. 杜仲叶总黄酮含量测定方法研究 J. 西北农业科技大学学报: 自然科学版, 2001, 29( 5): 119- 123.13 付桂明, 万茵, 周建斌. 杜仲叶醇提液中黄酮测定方法的比较研究 J. 中国食品学报, 2006, 6( 1) : 224- 229.The Studies on the Extraction Process of Total Flavonoids in Bamboo Leaves CHEN Yu, Deng Jin-mu, Lin Li-li, Wu Hui-long, Yang Jian-jian, Zhong Hong-jin （Department of Environment and Life science of Putian University, Putian, 351100）Abstract: The study aimed to investigate the optmium extraction technology for flavonoid compounds from the bamboo leaves and provided a theoretical basis for the utilization of bamboo leaves. With bamboo leaves as the tested material and ethanol as the solven, the content of total flavonoids in bamboo leaves was detected by visible spectrophotometry. The effects of ethanol concentration, ratio of sample with ethanol solution, extraction temperature, extraction time on the extraction yield of flavonoids were studied through the single factor test and the optmium technology conditions of extracting the total flavonoids were optmized by using the orthogonal experiment. Single factor test and orthogonal tests showed that the factors that affected the extraction yield of flavonoid were in the order of ratio of sample with ethanol solution alcohol concentration extraction temperature extraction time . The optimal determination conditions as follows: the 60% ethanol was used as impregnant, the ratio of sample with ethanol solution 120, the total flavonoids were extracted at 60 for 4 hours. The average content of total flavonoids in bamboo leaves was 7.88mgg-1 under the optimal determination conditions.Keywords: bamboo leaves ; total flavonoids; orthogonal experimentResponse Surface Methodology to Optimize Extraction Process of Total Flavones from Bamboo LeavesResponsing surface methodology to optimize extraction process of total Flavonoids from bamboo leavesAbstract: The study of the best technology on alcohol extraction of flavonoids from bamboo leaves by watering bath provides theoretical basis for development and utilization of bamboo leaves. Using bamboo as the test material, and alcohol as solvent, we can test the content of flavonoids in bamboo leaves with the spectrophotometry method. Through a single experimental study on alcohol extraction temperature, density, feed, effect on the rate of extraction of total flavonoids extraction time, extraction yield of flavonoids in response value, we design 4 to 3 levels of response surface analysis tests to determine the optimal conditions for extraction of total flavones from bamboo leaves. Form factors and response surface methodology show that: by Box-Behnken design，we built 4 optimization of impact factors for optimum process conditions of extracting total flavonoids .And the best extraction condition is that: 55% alcohol concentration, feed better than 1g:35.8mL, 72 water bath temperature and 3.48h response time.Discuss with ethanol-extraction water bath method extracting flavonoids ingredients in bamboo leaves the best technology, for the development and utilization of bamboo leaves to provide the th