RNA提取详细步骤及注意事项_第1页
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文档简介

.,RNA提取,高级生化与分子生物学研究技术,.,目录,1、试剂介绍2、主要提取流程3、详细步骤4、注意事项,.,1、试剂介绍,本实验室提取RNA常用的抽提剂是全式金Trizol。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。,.,2、主要提取流程,磨样,加氯仿,转移水相,加乙醇,室温晾干,保存,溶解RNA,测浓度,胶状物,加Trizol,去杂质,.,1、剪取新鲜幼嫩叶片，置于液氮中慢慢反复研磨，直至其成为合格粉末为止。2、加入1mlTrizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解。3、室温放置5分钟，使样品充分裂解。12,000g、4离心10分钟。4、每毫升Trizol加入0.2ml氯仿，猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。5、12,000g4离心15分钟，然后吸取上层无色水相至一新的离心管中。,3、详细步骤,.,6、按1ml最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。7、12,000g、4离心10分钟，弃上清，在管底可见RNA沉淀（透明胶状）。8、每毫升最初的Trizol加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），剧烈震荡。9、7,500g、4离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（5,000rpm,离心1分钟），小心吸尽液体。10、待RNA略干后，加入20lDEPC水溶解，-80冻存。,.,4、注意事项,1、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染。耐高温器物可放置于150烘烤4小时以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。2、必须戴一次性口罩和一次性手套操作。尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。3、提取RNA整个过程中，尽量在低温下操作。,.,4、在操作中当加入变性剂氯仿后，须剧烈震荡，这样才能彻底使两相混匀。5、在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，80下30min或2
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