紫外-可见光检测器(2).docx

紫外-可见光检测器 第二节 仪器结构紫外-可见光检测器属于吸收光谱分析类型的仪器，光的吸收定律即朗伯-比耳定律是该类分析仪器的工作原理。因而紫外-可见光检测器的基本结构与一般紫外可见分光光度计是相同的，均包括光源、分光系统、试样室和检测系统四大部分。从光源和分光系统可以得到朗伯-比耳定律中要求的单色光，单色光通过试样室（即流通池）时，一部分光被试样室中的待测吸光物质吸收，剩余的透射光到达检测系统的接收器（注：光电二极管阵列检测器的光路与上述过程不相同）。接收器实际上就是光电转换器，它能把接收到的光信号转换成电信号，再经过电子线路的放大等，最终得到与待测吸光物质浓度成正相关的仪器输出信号。一、分类随高效液相色谱的发展，紫外-可见光检测器也发展为多种类型，用于满足不同分析任务及各种紫外吸收物质检测的需求。 紫外-可见光检测器按光路系统分，有单光路（单光束，single beam）和双光路（双光束，doublebeam)两种。 单光路检测器直接测量流动相通过检测池时，是以其中所含样品对紫外光的吸收引起接收元件输出信号的变化来获得样品浓度。由于是单光路，也无补偿电路，对流动相性质、温度、流速等外界因素的变化很敏感。虽然结构简单，但稳定性不佳，目前已很少采用。双光路检测器包括检测光路和参比光路两部分，它有几种不同的结构类型（图4-3-2）。例如不设参比地，只以空气作参比的非对称双光路（a）；只有一个光源的单光源双光路（b）、（c）、（d）；有两个光源的双光源双光路（e）。双光路检测器系统的共同之处是利用两个接收元件分别接收来自样品池和参比光路的光束，以两者的光强差为输出信号反映被测样品的浓度。参比光路的主要部分按具体情况可以是充满流动相的参比池，连续流过流动相的参比池，也可以是不设参比池、只以空气作参比。双光路检测系统的最大优点是补偿了由于电源电压变动引起的光源强度改变，因而提高了检测器的稳定性，降低了噪声和漂移。 紫外-可见光检测器按波长来分，有固定波长和可变波长两类。固定波长检测器又有单波长式和多波长式两种；可变波长检测器可以按照对可见光的检测与否分为紫外-可见分光检测器和紫外分光检测器；按波长扫描的不同又有不自动扫描、自动扫描和多波长快速扫描等。其中属于多波长快速扫描的光电二极管阵列检测器具有很多优点，是液相色谱最有发展前途的检测器。二、结构 不同类型的紫外-可见光检测器的结构差异主要体现在光源、与光源相匹配的光路、分光系统与检测系统方面，检测池结构与检测器类型之间则关联不大。下面对不同类型检测器做一具体介绍。（一）可变波长紫外-可见光检测器 为了提高固定波长式紫外吸收检测器的应用范围，按照被测试样的紫外吸收特性任意选择工作波长，提高仪器的选择性等要求，发展了可变波长紫外-可见光检测器。可变波长紫外-可见光检测器也是一种应用非常广泛的检测器，虽然固定波长检测器可以提供多种光源波长进行检测，但可变波长检测器的波长选择是任意可调的，因此与固定波长检测器相比，有以下优点： 可以选择样品的最大吸收波长作为检测波长，提高检测灵敏度。 可以选择样品有强吸收而干扰无吸收的波长处进行分析，提高分析的选择性。 可以选择在梯度洗脱时，流动相改变，而其吸光度不变的波长下进行检测，有利于梯度洗脱。可变波长检测器在广义上讲主要可分为两种类型：色散型检测器和光学多道检测器（通常意义上的可变波长检测器仅指色散型检测器）。两种类型检测器都使用连续光谱光源，如氘灯、氙灯，其中氘灯最为常用。色散型检测器通过停流（停泵）扫描或不停流（不停泵）扫描获得样品的紫外吸收光谱图；光学多道检测器不停留、在一次色谱操作中可同时得到吸光度-时间-溶质紫外光谱图的三维图谱。两种类型检测器在光路上有重要区别：色散型检测器中，入射光在进入流通池之前已经色散，因此通过流通池的光实际上是单色光。光学多道检测器以光电二极管阵列检测器为代表。在光电二极管阵列检测器中，光源所有波长的光都会通过流通池，透过光被多色仪色散，得到的色散光谱带聚焦在二极管阵列上，每个二极管探测不同波长的光。另外，由于光敏元件上检测到的光除了光源发出的光，还可能包含荧光，因此流通池的入射光单色性越强，则荧光效果越小，定量结果准确可靠。就以上这点而言，色散型检测器较二极管阵列检测器还是有一定的优越性。1. 结构通常意义上的可变波长检测器，就是装有流通池的紫外分光光度计或紫外可见分光光度计。图4-3-9是一个普通可变波长紫外吸收检测器的结构图。从氘灯发出的多色光经过透镜及滤光片聚焦在单色仪（主要部分为光栅）的入口狭缝上，单色仪选择性地将一窄谱带的光透过出口狭缝。从狭缝出来的光束经过流通池，被其中的溶液部分吸收。通过测定吸收后到达光电二极管的光强度与空白参比时的光强度，来确定样品的吸收值。大部分可变波长检测器通过一分光器将光束的一部分送到在参比一侧的第二个光电二极管。参比光束以及参比二极管用于补偿因光源波动产生的光强变化。由于经过分光器分光后，单色光强度变弱，故灵敏度比固定波长检测器低。氘灯一般用作分光检测器的紫外光部分的光源，光强度大，稳定性好。与同样设计和相同电压下的氢灯相比，氘灯的强度是氢灯的3-5倍。因此近年来紫外光源多以氘灯代替氢灯。高压氘气被电子激发放电形成连续发射光谱，最低波长可达165nm。石英光窗吸收200nm 以下波长的光，对低紫外波长的氘灯发射光谱是个限制因素。另外，随着波长加大，氘灯强度降低。常规氘灯的使用范围在195nm-400nm之间。 可见光源一般为钨灯，使用范围在400nm-850nm之间。可见光源还有石英卤灯、碘钨灯等，可延伸可见光区到近红外光区。尽管氘灯在350nm-700nm 的发射光强度仅为紫外光区的十分之一，但近年来一些仪器制造厂家已成功地将氘灯应用到可见光区。使用高强度的氘灯（辉度是普通强度氘灯的2倍，甚至3-5倍），能够弥补350nm以上可见光区部分噪声的相对提高；利用硅光电二极管的量子效率随波长增加而增加；用滤光片代替光栅作为单色光元件，减少分光带来的光强损失等等。以上这些措施和特点都有利于在整个紫外可见光区使用单一光源。单色光系统包括聚光镜（凸凹面镜及反射镜）、狭缝机构和单色器，主要部件是单色器。可变波长检测器采用光栅作单色器。光栅单色器的优点是固定的狭缝宽度可以产生几乎恒定的带宽，色散均匀，呈线性，与波长无关。可变波长检测器与一般分光光度计相比，前者对波长的单色性要求不高，光谱宽度可达10nm，波长精度约1nm。常用流通池除了上一节提到的各种设计外，为了提高通过流通池的光通量，加强信号，并保证光束平行以防止反射和杂散效应，一些厂家还设计了可控光学成像流通池（图4-3-10）。采用五个精密棱镜，经多次聚焦，将来自单色器、经过样品的平行光束，尖锐地聚焦在光电二极管上，消除了折光效应的影响，从而获得平直的基线和很好的灵敏度。现有的紫外-可见光检测器大多性能完备，具有完善的自诊功能，操作和维修方便。例如，在光路上加氧化钬滤光片（HO2O3,3个校正波长）或氧化钬的高氯酸溶液（14 个校正波长），用于紫外及可见光区的波长校正；光源的更换无需调整光路；拥有一定寿命的部件的工作时间能记忆显示；拥有多种选择、更换方便的流通池微型池、高压池、制备池和标准池等。选择的原则可参考表4-3-5。表4-3-5 流通池的选择 2. 特殊技术 随着计算机技术的迅速发展，检测器的功能也得到不断开发，如微机控制程序改变波长（波长程序），双波长同时测定等。这些功能提高了紫外-可见光检测器的灵活性、可靠性、灵敏度和稳定性，降低了干扰，满足现代液相色谱对检测器的要求。 痕量分析中，灵敏度的提高是非常重要的。为了使色谱分析过程中各个组分峰都获得最灵敏的检测，要求单色器能够编程控制，便于在运行过程中自动变换波长。图4-3-11表示一个多核芳烃样品的紫外吸收色谱图。其中（a）仅在254nm（固定波长）下检测，（b）使用了波长程序。可以看出，波长程序明显地提高了某些成分的灵敏度，对不止一种成分的高灵敏度检测明显。 此外，波长程序还可改变化合物的选择性，降低干扰。图4-3-12 中，只有选择357nm作为检测波长才能消除其它化合物对血浆中四环素测定的干扰。波长程序还可用于提高液相色谱定量分析的重现性，这是因为在化合物最大吸收波长处的不稳定对定量分析结果的影响要比在其它波长处小得多。双波长检测可用于评价色谱峰纯度、重叠色谱峰的定量以及去除干扰等。双波长检测除了可在固定波长检测器上实现外，可变波长检测器也有双波长同时测定的功能。例如在维生素测定中，一般情况下采用较长波长270nm测定，可以避开杂质干扰，但泛酸峰几乎测不出；如果采用210nm检测，杂质影响大，而且核黄素的响应也较小。利用双波长同时测定，上述情况不再成为问题。 为了从色谱图中得到更多的信息，在双波长检测的基础上还可以给出两个波长色谱检测的比例色谱。对于遵循朗伯-比耳定律的某组分两波长的吸光度之比，应该等于该组分的摩尔吸光系数之比。从上式可以看出，组分的吸收比是个定值，与浓度无关。在复杂化合物的色谱分离中，有时一个色谱峰不一定只代表一个单一组分，可能是由未完全分离的两个（或更多）组分组成，给色谱定性带来困难。由于在比例色谱图中，不同组分的吸收比是特征的，因而由未完全分离的两个（或多个）组分组成的比例色谱的顶端就会发生弯曲。图4-3-13是双波长色谱和比例色谱的示意图，从比例色谱中可以得到两个重要信息： 色谱峰的纯度。如果是单一组分色谱峰，则比例色谱的顶端不会弯曲，色谱峰呈现矩形。图中色谱峰1、2 为纯组分，3 为两组分。 比例色谱的高度。如果是单一组分色谱峰，则比例色谱的高度是该组分固有的性质，与浓度无关，可用于定性。 比例色谱图中显示的吸收比又称响应比率（response ratio），对于浓度敏感型检测器，如荧光检测器、折光检测器等，比例色谱图的响应比率同样能提供一定的定性信息。据不完全统计，以保留时间定性的准确度为75%左右，再借助于比例色谱技术，定性的准确度可提高到95%。除了可以利用保留时间和比例色谱的高度进行定性外，许多紫外-可见光检测器还具有光谱扫描功能。不管是停流（光谱）扫描，还是不停流（光谱）扫描，得到的组分的紫外吸收光谱都能提供一定的定性信息。这里的停流、不停流扫描是指当进行待测组分的检测波长光谱扫描时，流动相的流动状况是停止的（停泵），还是正常流动的（不停泵）。光谱扫描时要求得到平直的基线，为此需要进行流动相背景校正。可以采用先贮存流动相的光谱，再在后来的光谱扫描中扣除贮存的流动相光谱的方法。不自动扫描的紫外-可见光检测器只能采用停流扫描。具有停流扫描功能的检测器价格相对便宜，但停流可能引起峰扩展。扫描时间往往需要数秒甚至数分钟才能完成，这同波长范围有关。通常，一个普通的可变波长检测器进行光谱扫描的时间要长于组分色谱峰的洗脱时间（即色谱峰宽）。为此，近年来许多研究者致力于提高光谱扫描速度，实现不停流状态下的跟随色谱峰自动扫描。由于微型计算机技术的发展，产生了新颖的多波长快速扫描紫外-可见光检测器，而传统的光吸收检测器都是在单波长下工作。多波长快速扫描检测器与传统紫外吸收检测器的区别在于，光源发射的光在整个波长范围内全部通过流通池，而不是选择一定波长的光通过流通池。多波长快速扫描紫外吸收检测器的特点是：快速光谱采集；在实时波长切换下，多组分的高灵敏度、选择性检测；利用内参比方法，即在一个检测波长（或范围）下，选择另一个波长（或范围）的信号为参比信号，可以降低噪声，抑制梯度洗脱的基线漂移、抑制溶剂折光效应，并可以对未分离色谱峰进行峰隐除处理；宽谱带检测；峰纯度检测等。 光谱扫描主要采用两种办法：一是在原有的波长扫描基础上改革扫描机构及数据采集方法，提高扫描速度。可以用微处理器控制光栅移动进行多波长扫描。由于仍采用光电倍增管做接收元件，价格便宜，可靠性好，灵敏度高。还可用控制电路控制反光镜角度，达到全