第二章 灭活疫苗

.,第二章灭活疫苗,.,疫苗,活疫苗-减毒活疫苗减毒不够：在使用时有致病的可能性过分减毒：造成免疫原性不足或丧失，失去活疫苗的效力灭活疫苗,.,传统的灭活疫苗,将病原体(病毒、细菌及其他微生物)经培养增殖、灭活、纯化处理使其完全丧失感染性具有较好的安全性保留了病原体的几乎全部组分具有较强的免疫原性,.,传统灭活疫苗的缺点,制备灭活疫苗需要大量抗原难以培养或尚不能培养的病原体（乙型、丙型和戊型肝炎病毒及麻风杆菌等）难以制备或无法以制备危险性大的病原体（艾滋病病毒）存在较大风险,基因工程手段-新型疫苗,.,第一节灭活疫苗概述及现况,.,一、灭活疫苗概述,灭活疫苗：用免疫原性强的病原微生物或其代谢产物，接种于动物、鸡胚、组织或细胞培养物中生长繁殖后，经灭活处理使其失去致病力，但仍保留免疫原性而制成的生物制剂。,.,灭活疫苗,主要成分：由细菌体或病毒颗粒组成疫苗中含有的菌体或病毒颗粒是“死”的，故又称作死疫苗。接种途径：通常是注射途径进入人体后不能生长繁殖，故比较安全、稳定需多次接种，才能产生比较牢固的免疫力。,.,灭活疫苗,细菌性灭活疫苗1886年，加热方法灭活猪霍乱菌1896年，制备全霍乱弧菌灭活免疫原1935年，福尔马林乙型脑炎鼠脑疫苗1937年，用鸡胚生产流脑灭活疫苗病毒性灭活疫苗1949年，发明人体胚胎组织体外培养方法，使病原体的体外培养成为可能,.,二、灭活疫苗的研究现状,近年的研究方向:（1）针对其不足部分，进行不断改进和完善；（2）探索新的研制途径。,.,二、灭活疫苗的研究现状,具体来说：（1）增强其诱导的免疫反应、改进疫苗免疫效果、延长持续时间；（2）选择新的灭活剂，并探索现有灭活剂对病原体的作用原理，不断研制新疫苗。,.,二、灭活疫苗的研究现状,病毒性灭活疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗甲型肝炎流行性乙型脑炎流感细菌性灭活疫苗,.,（1）脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivatedpoliomyelitisvaccine，IPV),研究始于1909年，但进展缓慢。1952年，Salk用猴肾上皮细胞培养了三个血清型的病毒1953年，制备出IPV(又称Salk疫苗)免疫人体，获得较高效价的血清中和抗体中和进入血液中的脊髓灰质炎病毒，从而防止麻痹症的出现。1955年开始在美国、加拿大和欧洲国家逐渐推广使用，取得了良好的保护效果。,.,（1）脊髓灰质炎灭活疫苗的制备,猴肾细胞、人二倍体细胞或Vero细胞,病毒,病毒悬液,灭活,37C，pH7.0，福尔马林（1:4000）,脊髓灰质炎灭活疫苗,12-15天,皮下注射三次接种,.,（2）甲型肝炎,甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus，HAV)引起的急性传染病，主要通过粪-口途径传播。病毒的体外培养原代恒河猴肝细胞传代恒河猴胚肾细胞株(FRhK6)HAV灭活疫苗Havrix（美国SmithKline公司）Vaqta（美国Merck公司）AVAXIM（法国巴斯德血清和疫苗研究所）,1979年，Provost和Hilleman,.,（3）流行性乙型脑炎,夏秋季，经蚊子叮咬传播，是人畜共患的中枢神经系统传染病。1954年，灭活疫苗在日本问世（中山株/鼠脑）1968年，中国从开始生产（P3株/原代仓鼠肾细胞）1988年，WHO颁布了生产规程。,.,（4）流感,由流感病毒引起的，具有高度传染性的急性呼吸道传染病流行病学特点:突然暴发，迅速蔓延影响面大，发病率高伴有一定的死亡率。,.,（4）流感,流感病毒的毒粒表面的抗原变异问题血凝素(hemagglutinin，HA)神经氨酸酶(neuramindase，NA),.,抗原性的变异形式-甲型流感病毒,抗原漂移亚型内HA和/或NA不断发生点突变突变不断积累，使抗原位点发生构型改变导致人群特异性免疫失败导致流感病毒流行抗原变异指一种新HA和/或NA亚型在人群中突然出现，起因未明。,量变,质变,.,流感病毒抗原,特点：抗原的多变性抗原的漂移存在多种亚型,（1）人类对流感病毒普遍的易感性（2）不易从以往获得的抗体，得到有效的保护,导致,因此，虽然1937年就用鸡胚培养流感病毒获得成功，但至今尚无十分满意的制品。,.,流感病毒疫苗,长春生物制品研究所新型精制三价流行性感冒灭活疫苗临床免疫效果评价（2000年）,临床反应,轻微（0.98%）,血清抗体阳转率,99%-100%,1年以上,好,免疫力持续时间,疫苗稳定性,总反应率：与国外同类疫苗无明显差别，具有良好的安全性。,.,2.细菌性灭活疫苗,致病机理、免疫机理研究长期无突破性进展因此难以进行疫苗研制，使有些疾病长期得不到有效控制。,细菌本身结构组成复杂基础研究的滞后,.,2.细菌性灭活疫苗,存在问题：有些病原体属于人畜共患，解决起来较为困难;消化道传染病:疫苗诱生的局部免疫力较弱，免疫力持续时间较短，使用效果往往不好，易于重复感染;有的灭活疫苗副作用大，甚至引起严重后遗症或造成死亡，可接受性极差。,.,（1）伤寒杆菌灭活疫苗,伤寒杆菌-引起伤寒发病的主要病原1886年，英国的Wright、德国的Pfeiffer和Kolle分别制备出全菌体灭活疫苗丙酮灭活疫苗：保护率较高，但副反应也高，难以推广。Vi荚膜多糖疫苗：安全，但保护率又较低。,.,（1）伤寒杆菌灭活疫苗,新型伤寒疫苗Ty21a活疫苗口服活疫苗，保护率达96%，目前已在全世界使用;Vi荚膜多糖疫苗将伤寒杆菌培养后，对其Vi荚膜多糖抗原进行提纯精制的一种组分疫苗制备工艺简单，安全性好，已在全球推广使用，目前我国多家生物制品单位均能生产。,.,（2）霍乱灭活疫苗,霍乱弧菌引起的一种烈性传染病1884年，Ferran研制出霍乱疫苗（注射）保护期短，副反应大。霍乱全菌体灭活疫苗(wholecellvaccine，WCV)霍乱WCV-霍乱毒素B亚单位(Bsubunitofcholeratoxin，CTB)对小鼠胃肠外免疫，能抵御霍乱毒素(choleratoxin，CT)2.25-3LD50的攻击，免疫效果与CVD103-HgR减毒活疫苗相同。,.,（2）霍乱灭活疫苗,口服B亚单位-全菌体(Bsubunit-wholecell，BS-WC)霍乱疫苗（1980s，瑞典）疫苗的保护期：3年头半年保护率是85%，3年后是51%。,.,（2）霍乱灭活疫苗,重组霍乱毒素B亚单位-全菌体疫苗(recombi-nantBsubunit-wholecell，rBS-WC),又称冻干口服霍乱疫苗中国军事医学科学院（1997年）2000年取得国家一类新药证书免疫保护时间：3年。独到之处：生产B亚单位抗原的工程菌是大肠杆菌，较国外用霍乱减毒株工艺操作安全、方便;疫苗剂型是胶囊，较国外的水剂便于服用且价格低廉。,.,（3）百日咳灭活疫苗,儿童常见的呼吸道传染病，传染性强，临床上主要引起痉孪性阵咳。1932年，Kendrick用羊血包姜培养基，经硫柳汞灭活制备疫苗成功；1981年，纯化百日咳杆菌抗原组成的无细胞百日咳疫苗（日本）优点：青少年和成人较易接受，并有可能实施加强免疫。,.,（3）百日咳灭活疫苗,2001年3月，日本一个科研小组使用茶叶中的儿茶素制造无毒百日咳疫苗获得成功，免疫功能更强，副作用更小。福尔马林灭活的疫苗：常常引起炎症等病症儿茶素灭活的疫苗：不会产生这些副作用,.,灭活疫苗的研究现状,1.病毒性灭活疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗甲型肝炎流行性乙型脑炎流感2.细菌性灭活疫苗伤寒杆菌霍乱百日咳3.无针注射免疫法,.,3.无针（喷射）注射器,起源：美军细菌战的发明在疫苗接种的应用：1954年，白喉和破伤风类毒素疫苗的大规模接种原理：通过细小、有高压的疫苗液体流，直接注射到皮下。,.,3.无针（喷射）注射器,.,无针注射法的免疫应答效果,法国和南非（共1500多人）流感灭活疫苗(Vaxigrip)Vi多糖伤寒疫苗(TyphimVi)破伤风类毒素(Tetavax)百白破全细胞疫苗(DTCoq)甲肝灭活疫苗(Avaxim)与常规注射器在皮下、皮内、肌内等免疫途径进行了比较。,.,无针注射法的免疫应答效果,评估标准血清抗体阳转率抗体几何平均滴度值注射部位的局部反应结果抗白喉和抗破伤风的阳转率偏低其他的疫苗免疫效果均高于或与常规接种方法一致接种时的局部反应都很小，而且都是瞬时的。,.,3.无针（喷射）注射器,优点：使用便捷，每次接种只需更换疫苗管；无需人员的专业培训；更好地激发机体产生良好的免疫应答与常规肌内注射相比，注射部位浅，但所造成的创面更大，而且疫苗被输送到表皮深层，在这个部位有更多的免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞等)，抗原能够更好地和这些细胞结合,.,三、联合免疫研究现状,理想的疫苗：含有多种有良好免疫原性和稳定性的抗原、生产成本低廉、接种途径简单以及一次接种能产生多种免疫和无毒副作用的疫苗。1991年，儿童免疫计划(ChildrensVaccineInitiative，CVI）改进现有疫苗，并创制新的疫苗联合免疫得到了进一步的推进。,.,.,联合疫苗的分类,多联疫苗预防不同病原体引起的传染病百白破联合疫苗预防百日咳、白喉和破伤风三种不同的传染病多价疫苗仅预防一种病原体不同血清型引起的传染病肺炎多糖疫苗由代表23种不同血清型的细菌多糖组成，但只能预防肺炎球菌的感染。,.,影响联合免疫效果的因素,联合疫苗中各组分间的化学和物理作用可影响疫苗的免疫应答。如佐剂、缓冲剂、贮存剂和赋形剂等通常需要重新配伍。,.,影响联合免疫效果的因素,多价疫苗问题较易解决，因疫苗中含有相同的成分，其中一个组分的稳定配方通常适用于其他组分，但也需要对每一个组分做专门的测试以保证成品的理化配伍性和稳定性。活病毒间可相互干扰，如一个病毒可因激活免疫应而产生干扰素从而抑制另一个病毒。,.,影响联合免疫效果的因素,多联疫苗一个组分的添加剂不一定能保证另一组分的稳定性如：DTwcP/IPV联合疫苗中，用于DTwcP的防腐剂硫柳汞可破坏IPV活性，故不能混装在一个瓶中，需采用双室注射器。DTwcP：百白破疫苗IPV：脊髓灰质炎灭活疫苗,.,第二节灭活疫苗制备的技术要求,.,一、灭活疫苗的设计要求,1.制备过程病原体的培养灭活剂和灭活方法的使用疫苗的后处理,.,（1）病原体的选择,必需具有很强的免疫原性具有恒定的培养特性和生化特性，不易变异易于在人工培养基上或特定的组织或细胞中培养并可进行规模化生产,.,病原体的选择,在培养过程中不产生或产生较小的毒性;制备类毒素的菌种：在培养过程中能产生大量的典型毒素;要针对不同的病原血清型选择符合当地流行的菌、毒株，以保证所制造的疫苗具有良好的免疫效果,.,灭活方法的选择,灭活方法的选择关系到疫苗质量的好坏灭活剂（关键）灭活条件灭活时间既要考虑其对疫苗抗原性的破坏作用，同时又要避免其对毒素的脱毒后又发生毒性逆转现象。,.,细菌性灭活疫苗和类毒素的制备工艺,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,研究证明:很低浓度的福尔马林即能使外毒素完全脱毒并能保持其良好的免疫原性，表明福尔马林是一个较为理想的脱毒剂。福尔马林的脱毒作用较为复杂，在使用时要特别注意影响福尔马林脱毒的四个因素,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,温度pH福尔马林浓度毒素种类,这四者相互联系、相互影响，改变其中任何一个因素都会产生不同的结果，故在制备疫苗时要综合考虑，选择最佳的脱毒条件。,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,温度在其他因素固定的条件下温度越高，脱毒越快脱毒温度类毒化时间就会延长如需加快作用时间：必须提高福尔马林浓度和pH。,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,温度-视具体的疫苗种类而定一般脱毒温度：37-39脱毒温度40破坏外毒素的抗原性产生外毒素的菌种：在较低温度下脱毒效果更好,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,微酸条件下（pH6.3）脱毒时间很慢，需要较高的福尔马林浓度如福尔马林浓度较高，脱毒完成后会剩余较多的游离福尔马林，使类毒素的脱毒过甚，损害了类毒素效力的稳定性。,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,碱性条件下脱毒快，可用较低的福尔马林浓度。pH=7.28.6，福尔马林浓度的使用和pH成反比。在强碱性溶液中脱毒，类毒素的抗原性损失会加大。因此，外毒素脱毒时pH很重要，通常以微碱性为最好。,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,福尔马林浓度福尔马林浓度脱毒速率浓度越高，脱毒时间越快，其抗原性的损失也越大。,.,福尔马林对外毒素脱毒的影响因素,毒素的种类不同种类外毒素分子量和分子结构不一，不同菌株要使用不同培养基不同的外毒素中均含有不同种类及不同浓度的含氮物质，如蛋白质、肽类和氨基酸等，这些化合物都能与福尔马林起作用。所以，不同外毒素在脱毒时所使用的温度、pH和福尔马林浓度是不一样的,.,二、病毒性灭活疫苗的设计及制备要求,病毒病原体自身的结构组成和生物学活性较为简单，在考虑制备灭活疫苗时，一般将全部病毒颗粒用来作为疫苗抗原，以寻求其最佳的保护效果。,.,病毒性灭活疫苗的优点,制备工艺较为成熟，免疫原的稳定性高，培养的病毒含量达到要求滴度即可进行大量生产，较易制备多价疫苗;由于不存在活病毒颗粒，没有感染问题，安全性好;保存方便，一般无需冻干保存。,.,病毒性灭活疫苗的缺点,制备疫苗的毒株为强毒株，如在制备过程中灭活不彻底，极易酿成重大事故;由于所诱导的免疫反应持续时间较短，需多次进行免疫接种，可能引起过敏反应;由于需要的抗原量大、质纯，因此要求对疫苗进行浓缩和纯化；,.,病毒性灭活疫苗的缺点,由于灭活疫苗接种不是通过自然感染途径，一般不能诱生局部IgA免疫抗体，使外来病毒仍可侵入门户，并在局部繁殖，保护效果不甚满意;5由于灭活剂对病毒的抗原性有一定影响，灭活疫苗需要添加佐剂。,.,病毒性灭活疫苗制备工艺流程,.,第三节疫苗灭活方法对机体免疫应答的影响,.,一、灭活方法及其作用原理,1.物理作用灭活加热紫外线,.,加热灭活,原理：使蛋白质变性从而使病原体失去传染性简单有效56-57水浴1h注意:使内容物受热均匀不同的病原体对热的耐受性不同,.,紫外线照射灭活,原理使病原体的DNA形成TT二聚体，无法作为模板转录为mRNA，不能复制子代DNA与合成蛋白，从而使病原体失去感染性。优点在DNA、RNA水平上对病原体进行灭活，最大限度地保留了抗原的完整性和免疫原性。尚未运用于实际的疫苗生产灭活程度不完全，且病原体有光复活的可能。,.,2.化学作用灭活,灭活剂福尔马林、丙酮、苯酚-丙内酯(-propiolactone，BPL)乙烯亚胺(ethylenimine)双乙烯亚胺(binaryethylenimine，BEl)磷酸三丁酯、乙醇、硫柳汞等。,.,（1）福尔马林,传统的灭活剂，应用最广泛。灭活机理：作用于病毒核酸病毒核酸中含氨基的核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶)发生反应。作用于病毒壳蛋白使氨基酸或氨基酸基团暴露，引起蛋白质变性以阻碍核酸从病毒颗粒中释放，使病毒失去感染力。,.,（1）福尔马林,灭活病毒的种类：乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、狂犬病毒、森林脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、巨细胞病毒、甲型肝炎病毒和HlV等灭活细菌的种类：伤寒杆菌、短棒状杆菌、绿版杆菌等。,.,（1）福尔马林,疫苗内残余的福尔马林含量较高时(1:2000)注射局部可引起疼痛使用亚硫酸氢钠中和后可消除痛感。,.,（2）-丙内酯(-propiolactone，BPL),广泛地应用于多种人和动物疫苗的生产可能作用机理：作用于病原体的DNA和RNA，而不直接作用于蛋白。它能在机体内完全分解为无毒性的-羟丙酸，这是一种人体内脂肪代谢后的产物，对人体和动物体无毒。,.,（2）-丙内酯（BPL）,一种不稳定的液体加热372h能自行水解为一种无毒的物质，也可加入亚硫酸钠停止其反应。1984年被选作狂犬灭活疫苗的灭活剂正式使用,.,（2）-丙内酯（BPL）,缺点:本身具有致癌性，对工作人员仍有致癌作用，需要加以特殊防护;BPL可以改变人血清白蛋白的性质，引起人体全身性的变态反应，因此所灭活的病毒培养液中不能含有人血清白蛋白,.,（3）乙烯亚胺和双乙烯亚胺,乙烯亚胺灭活原理：类似于-丙内酯(BPL)无论在安全性还是保持疫苗的抗原性方面都较福尔马林更为优越。1955年灭活噬菌体口蹄疫疫苗，己在世界范围内生产使用,.,（3）乙烯亚胺和双乙烯亚胺,双乙烯亚胺（BEl）在碱性环境中由单体的乙烯亚胺结晶后形成更稳定、更安全BEl和BPL的灭活效果比用福尔马林几乎高两倍。,.,二、病毒灭活对机体免疫应答的影晌,不同灭活剂对不同病原体的作用机制不同，对疫苗的免疫原性影响各异，导致疫苗接种后不同的机体免疫应答。一般来讲，灭活疫苗所诱导的免疫水平较低，仅能诱导较低滴度的抗体水平，很难激发细胞免疫。,.,二、病毒灭活对机体免疫应答的影晌,主要原因：灭活使病原体的蛋白质受到破坏，有的变性失去了免疫原性;灭活后的病原体蛋白经过补体加工处理后，其肽段上的表位受到破坏，被抗原递呈细胞(APC)递呈给MHC-I类分子时，MHC-I类分子对这些表位的识别受到了限制，很难激发细胞免疫的产生。,.,不同灭活方法对疫苗免疫原