第12章 色谱法基础ppt课件

2020/4/27,.,第12章色谱分析基础,第一节色谱法概述,一、色谱法的特点、分类和作用characteristic,classificationactuationofchromatograph二、色谱法流出曲线及相关术语,fundamentalofchromatographanalysis,generalizationofchromatographanalysis,2020/4/27,.,一、色谱法的特点、分类和作用,1.概述混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,（动画）,2020/4/27,.,色谱法,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,（动画）,被固定相滞留强的组分迁移慢，被固定相滞留弱的组分迁移快两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,2020/4/27,.,从不同角度，可将色谱法分类如下：(1).按两相状态分类A、气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。B、液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）.,2.色谱法分类,2020/4/27,.,(2).按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。,2020/4/27,.,利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。（3）.按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。,2020/4/27,.,二、色谱流出曲线及有关术语,（一）色谱流出曲线和色谱峰混合物中各组分经色谱柱分离后随流动相依次流出色谱柱，由检测器将各组分的浓度信号转换为电信号，以电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(1)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(2)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；,2020/4/27,.,(3)根据色谱峰的面积或峰高，可进行定量分析；(4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据（二）基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。,2020/4/27,.,色谱流出曲线色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）,信号,进样,空气峰,色谱峰,h,a,（三）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。,2020/4/27,.,（四）峰宽,用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.355（3）峰底宽(Wb)：色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。Wb=4色谱峰与基线围成的面积。A=1.065hY1/2A=1.065h(Y0.15+Y0.85)/2,（五）峰面积,2020/4/27,.,（五）保留值1.死时间t0不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与t0的比值计算，即=L/t0,信号,进样,t0,2020/4/27,.,2.保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。,信号,进样,tR,3.调整保留时间tR某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR=tRt0,2020/4/27,.,由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。tR为组分在固定相中实际滞留的时间。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。,2020/4/27,.,4.死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fo（mLmin-1）计算。V0=t0Fo仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。,2020/4/27,.,5.保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系：VR=tRFo6.调整保留体积VR某组分的保留体积扣除死体积后，称为该组分的调整保留体积。VR=VRV0=tRFo,2020/4/27,.,7.相对保留值r2,1某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。r2,1=tR2/tR1=VR2/VR1由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。,2020/4/27,.,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号表示，即=tR(i)/tR(s)式中tR(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。,2020/4/27,.,8.分配系数（partionfactor）K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时，固定相和流动相中的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,2020/4/27,.,分配系数K的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组分在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；,2020/4/27,.,9.分配比（partionradio）k,在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。思考：分配系数K和分配比k之间有何种关系？,分配比也称：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；,2020/4/27,.,k=KVs/Vm分配比与保留时间的关系,若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则：,tR=tM(1+k),r2,1=tR2/tR1=k2/k1=K2/K1,2020/4/27,.,10、分离度相邻两组分保留时间之差与两组分峰宽之和一半的比值。,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,=1.18（tR（2）-tR（1)）/(Y1/2(1)+Y1/2(2),2020/4/27,.,例1、一个气相色谱柱，固定相的体积为Vs=14.1ml,载气流速为43.75ml/min。分离一个含A、B、C三组分的样品，测得组分保留时间分别为A1.41min、B2.67min、C4.18min、空气为0.24min。计算（1）死体积（2）各组分的调整保留时间和分配系数（3）相邻两组分的分配系数比,2020/4/27,.,解：V0=t0Fc=0.2443.75=10.5mltRA=tRt0=1.41-0.24=1.17mintRB=2.67-0.24=2.43mintRC=4.18-0.24=3.94minKA=(tRA/t0)(Vm/Vs)=1.17/0.2410.5/14.1=3.63KB=7.54KC=12.2AB=KB/KA=7.54/3.63=2.08BC=KC/KB=12.2/7.54=1.62,2020/4/27,.,第12章色谱分析基础,第二节色谱理论基础,一、塔板理论platetheory二、速率理论ratetheory三、分离度resolution,fundamentalofchromatographanalysis,fundamentalofchromatographtheory,2020/4/27,.,塔板理论的假设：(1)色谱柱由一系列连续相同的水平塔板组成，每个塔板高度为H。组分在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。,一、塔板理论-柱分离效能指标,1.塔板理论（platetheory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；,（动画）,2020/4/27,.,2020/4/27,.,色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,n越大H越小，柱效能越高，分离越好。保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!,2020/4/27,.,2.有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,2020/4/27,.,3.塔板理论的特点和不足,(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,2020/4/27,.,二、速率理论-影响柱效的因素,1.速率方程（也称范.第姆特方程式）H=A+B/u+CuH：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s),减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？,2020/4/27,.,A涡流扩散项,A=2dpdp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。空心毛细管柱A=0,2020/4/27,.,B/u分子扩散项,B=2Dg：弯曲因子，填充柱色谱，1,空心毛细管柱=1Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1），与载气的相对分子质量、组分的性质和温度、压力等有关。(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散;(4)扩散系数：Dg(M载气)-1/2；M载气，B值。,2020/4/27,.,Cu传质阻力项,传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：C=（Cg+CL）气相传质阻力是组分分子从气相到两相界面进行交换时的传质阻力。液相传质阻力是指组分分子从气液界面到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回到气液界面的传质过程。与固定液涂渍厚度和该组分在液相中的扩散系数有关。,2020/4/27,.,k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。,2020/4/27,.,2.载气流速与柱效最佳流速,载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。,H-u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,2020/4/27,.,三、分离度R,相邻两组分保留时间之差与两组分峰宽之和一半的比值。塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；区域宽度色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：,2020/4/27,.,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：,柱效较高，K(分配系数)较大,完全分离；K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，K较大,但分离的不好；K小，柱效低，分离效果更差。,2020/4/27,.,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,=1.18（tR（2）-tR（1)）/(Y1/2(1)+Y1/2(2),2020/4/27,.,令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：,R1/R2=(L1/L2)1/2,2020/4/27,.,讨论：P244,（1）分离度与柱效分离度与柱效的平方根成正比，r21一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长（2）分离度与r21增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。,2020/4/27,.,例1、已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；（3）达到1.5分离度所需的柱长度。,2020/4/27,.,解：（1）柱的分离度R=2（17.63-16.40）/（1.11+1.21）=1.06（2）柱的平均塔板数n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2=3397n平均=（3493+3397）/2=3445（3）达到1.5分离度所需的柱长度R1/R2=(L1/L2)1/2L1=30*(1.5/1.06)2=60cm,2020/4/27,.,练习题,1、在长为L的色谱柱上，分离组分1和组分2，载气的保留时间为t0，组分1和组分2的保留时间分别为tR1和tR2，组分1和组分2具有相同的峰宽Y1=Y2=Y。计算：（1）两组分的调整保留时间tR1，tR2（2）用组分2计算色谱柱的有效理论塔板数n有效和有效理论塔板高度H有效（3）两组分的容量因子k1和k2（4）两组分的分离度R和相对保留值r（5）要使两组分的分离度为1.5，所需的最短柱长L是多少？,2020/4/27,.,答案：（1）tR1=tR1-t0;=tR2-t0（2）n有效=16（tR2/Y2）2H有效=L/n有效（3）k1=tR1/t0K2=tR2/t0（4）R=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2)r=tR2/tR1（5）n需=16R2r2/（r-1）2L需=n需H有效,2020/4/27,.,练习,2、在某色谱中得到如下数据：保留时间tR=5.0min,死时间t0=1.0min，固定液体积Vs=2.0ml,载气流速F=50ml/min。计算（1）容量因子（2）死体积（3）分配系数（4）保留体积答案：4.0，50ml，100，250ml,2020/4/27,.,思考题,1、色谱法如何进行分类？2、气固色谱法和气液色谱法的分离机制有何不同？3、名词解释：死时间、保留时间、调整保留时间、死体积、保留体积、调整保留体积、分配系数、容量因子（相关计算）4、一个组分的色谱峰用哪些参数来进行描述？各参数具有何意义？5、塔板理论成立的假设前提是什么？6、理论塔板高度、理论塔板数和有效理论塔板高度、有效理论塔板数的概念是什么？如何计算？7、速率理论中影响柱效的因素有哪几项？各项又和哪些因素相关？8、根据速率方程讨论如何选择载气和载气流速？9、分离度的相关计算。,2020/4/27,.,第12章色谱分析基础,一、色谱定性分析qualitativeanalysisinchromatograph二、色谱定量分析quantitativeanalysisinchromatograph,第三节色谱定性、定量分析,fundamentalofchromatographanalysis,qualitativeandquantitativeanalysisinchromatograph,2020/4/27,.,一、色谱定性鉴定方法,1.利用纯物质定性的方法利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。,2020/4/27,.,2.保留指数,又称Kovats指数()，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：,2020/4/27,.,保留指数计算方法,2020/4/27,.,3.与其他分析仪器联用的定性方