第二章-氨基酸.ppt

第二章蛋白质的构件氨基酸,Aminoacid,本章重点内容氨基酸的结构和分类氨基酸的酸碱化学氨基酸的物理和化学性质,蛋白质(protein)是由许多不同的-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（蛋白质化学中专称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的生物大分子,一、蛋白质的化学组成和分类,蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：,碳50氢7氧23氮16%硫03其他微量,N的含量平均为16%凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础。,一、氨基酸蛋白质的构件分子,组成蛋白质的基本单位是氨基酸（aminoacid）。如将天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约20种不同的氨基酸。这些氨基酸中，大部分属于L-氨基酸。其中，脯氨酸属于L-亚氨基酸，而甘氨酸则属于-氨基酸。,蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g蛋白质）；故：蛋白质含量=氮的量100/16=氮的量6.25,蛋白质的分类,1.按照分子组成分类单纯蛋白质：水解产物只有氨基酸。结合蛋白质：水解产物中除了氨基酸外，还有金属离子和其它物质（辅基）。结合蛋白根据其辅基的不同有好多种。一种单纯蛋白质只能与特定的一种或几种辅基结合。,2.按照分子形状分类球状蛋白：分子近似球形或卵圆形，易溶解，能结晶。纤维状蛋白：分子纤维状，不对称。大多数不溶于水。,3.按照生物功能分类活性蛋白质：参与代谢反应的蛋白质。非活性蛋白质：对生物体起保护和支持作用的蛋白质。,活性蛋白质分类1.酶类（占细胞内蛋白质种类的绝大部分）;2.运输蛋白;3.收缩运动蛋白;4.激素蛋白;5.细胞激动素;6.受体蛋白;7.毒素蛋白;8.营养贮藏蛋白;9.防御蛋白等。,蛋白质的分布,蛋白质占干重人体中（中年人）人体45%水55%细菌50%80%蛋白质19%真菌14%52%脂肪19%酵母菌14%50%糖类1%白地菌50%无机盐7%植物：主要在种子中含量较高。,人体各组织器官中蛋白质含量（蛋白质g/100g干组织）,我国一些谷物主要成分含量,蛋白质的生物学功能,1.生物体的组成成分2.催化3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构,酶蛋白,结构蛋白,免疫球蛋白,蛋白质水解产物即为氨基酸的混合物，不同水解方法各有其优缺点。1、酸水解：不引起消旋作用，得到L-氨基酸，但Trp完全被破坏。2、碱水解：引起消旋现象，得到D-和L-氨基酸的混合物，Trp稳定。3、酶水解：不引起消旋作用，也不破坏氨基酸，但水解不彻底。,二、蛋白质的水解,完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。,二、蛋白质的水解,1.酸水解,方法：常用6mol/LHCl或4mol/LH2SO4，回流煮沸约20h。优点：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。缺点：色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解成羧基。,2.碱水解,方法：一般用5mol/LNaOH煮沸1020h。优点：色氨酸在水解中不受破坏。缺点：多数氨基酸受到不同程度的破坏，产生消旋现象，得到的是D-和L-氨基酸的混合物。此外，引起精氨酸脱氨（生成鸟氨酸和尿素）。,3.酶水解,方法：用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（或称蛋白酶,proteinase）已有十多种，常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（或称糜蛋白酶）及胃蛋白酶等。优点：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。缺点：使用一种酶往往水解不彻底，需几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解。该法主要用于部分水解。,除脯氨酸Pro外，其他19种氨基酸均具有如下结构通式。,三、-氨基酸的一般结构,-氨基酸的通式,可变部分,不变部分,除脯氨酸外，均为-氨基酸除甘氨酸外，均为手性氨基酸,手性,氨基酸的旋光性,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,氨基酸的构型除Gly以外，都有D-型和L-型2种立体异构体,蛋白质中发现的氨基酸都是L-型的（故习惯上书写氨基酸都不注明构型和旋光方向）。,用D/L体系表示在费歇尔投影式中氨基位于横键右边的为D型，位于左边的为L型。,除甘氨酸外，所有的氨基酸分子的-碳原子都具手性碳原子。因而都具有旋光性。而且发现主要是L型的。,三、氨基酸的分类,（一）按R基的化学结构分类可分为三类：脂肪族、芳香族和杂环族1、脂肪族氨基酸含一氨基一羧基的中性氨基酸,甘氨酸Gly,G,丙氨酸Ala,A,缬氨酸Val,V,亮氨酸Lue,L,异亮氨酸Ile,I,丝氨酸(Ser,S),苏氨酸(Thr,T),半胱氨酸(Cys,C),甲硫氨酸(Met,M),含羟基或硫氨基酸(一氨基一羧基),酸性氨基酸(一氨基二羧基)及其酰胺,天冬氨酸(Asp,D),谷氨酸(Glu,E),天冬酰胺(Asn,N),谷氨酰胺(Gln,Q),碱性氨基酸(二氨基一羧基),赖氨酸(Lys,K),精氨酸(Arg,R),组氨酸(His,H),杂环,2、芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trp,W）,3、杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,说明：关于杂环氨基酸和杂环亚氨基酸,色氨酸（Trg,W）,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,芳香族氨基酸,杂环亚氨基酸,杂环氨基酸,（二）按R基的极性性质分类,20种基本氨基酸可分成以下4组：1、非极性氨基酸（8种）Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp,2、极性不带电荷的氨基酸（7种）Ser、Thr、Tyr含羟基；Asn、Gln含酰胺基；Cys含巯基（-SH）；Gly（因-C上的H受易解离的-氨基和-羧基的影响，体现不出极性，故有的书中将其列为非极性类）,3、极性带正电荷的氨基酸,3种碱性氨基酸：Lys、Arg、His在pH7时带正电荷在pH6.0时，His的R基50%以上质子化，但pH7.0时，质子化的分子不到10%。His是唯一的R基的pKa值在7附近的氨基酸,4、极性带负电荷的氨基酸2种酸性氨基酸：Asp、Glu,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine,中性脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,中性脂肪族氨基酸,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine,中性脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine,中性脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine,中性脂肪族氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline,亚氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine,含硫氨基酸,氨基酸的结构,甘氨酸Glycine丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline甲硫氨酸Methionine半胱氨酸Cysteine,含硫氨基酸,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine,氨基酸的结构,芳香族氨基酸,苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸Trytophan,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸Arginine,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸Arginine赖氨酸Lysine,氨基酸的结构,碱性氨基酸,精氨酸Arginine赖氨酸Lysine组氨酸Histidine,氨基酸的结构,天冬氨酸Aspartate,酸性氨基酸,氨基酸的结构,天冬氨酸Aspartate谷氨酸Glutamate,酸性氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸Serine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构,丝氨酸Serine苏氨酸Threonine,含羟基氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺Asparagine,含酰胺氨基酸,氨基酸的结构,天冬酰胺Asparagine谷酰胺Glutamine,含酰胺氨基酸,3个有个性的氨基酸,1）脯氨酸（Pro）因为是一个环状的亚氨基酸,它的氨基和其它氨基酸的羧基形成的肽键有明显的特点,较易变成顺式肽键.,2）甘氨酸（Gly）是唯一的在-碳原子上只有2个氢原子,没有侧链的氨基酸.为此它既不能和其它残基的侧链相互作用，也不产生任何位阻现象,进而在蛋白质的立体结构形成中有其特定的作用.,3）半胱氨酸(Cys)它的个性不仅表现在其侧链有一定的大小和具有高度的化学反应活性，还在于两个Cys能形成稳定的带有二硫（桥）键的胱氨酸。二硫键不仅可以在肽链内，也可以在肽链间存在。更有甚者，同样的一对二硫键能具有不同的空间取向。,二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号,据R基团化学结构分类,脂肪族A,芳香族A(Phe、Tyr、Trp),杂环(His、Pro、Trp),据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（种）,人体必需氨基酸MetTrpLysValIleLeuPheThr“假设来借一两本书”,（三）不常见的蛋白质氨基酸,存在于少数蛋白质中特殊的氨基酸，是在蛋白质生物合成后由相应的基本氨基酸衍生而来。,N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中。,-羧基谷氨酸存在于凝血酶原中;,羟脯氨酸存在于胶原蛋白中;,（四）非蛋白质氨基酸,大多是蛋白质中存在的L型-氨基酸的衍生物。但有一些是、或-氨基酸，且有些是D-型氨基酸。,细菌细胞壁组成中的肽聚糖中的D-氨基酸：D-谷氨酸、D-丙氨酸一种抗生素短杆菌肽S中含有D-苯丙氨酸。,-丙氨酸是遍多酸(泛酸,一种维生素)的前体成分氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质L-鸟氨酸、L-瓜氨酸是尿素循环的中间体,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,1、氨基酸的旋光性,四、氨基酸的物理性质,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(pI时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动当pHpI时，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移,等电点应用2-蛋白质/氨基酸沉淀与分离,处于等电点的蛋白质/氨基酸溶解度最小。当混合物的pH被调到其中一种成分的等电点时，该蛋白质/氨基酸的大部分或全部将沉淀下来。那些等电点高于或低于该pH的成分仍保留在溶液中，可利用此性质进行蛋白质/氨基酸的分离。,五、氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,氨基酸的酸、碱滴定的等当点过高或过低，没有适当的指示剂可以选用。与过量的甲醛反应生成单或双羟甲基氨基酸衍生物，促使氨基解离，碱性下降，再用酚酞做指示剂用NaOH来滴定。可测定游离氨基酸含量，可大体判断蛋白质水解或合成的速度,（1）与甲醛发生羟甲基化反应,羟甲基氨基酸,二羟甲基氨基酸,1-氨基参与的反应,（2）与亚硝酸反应,用途：范斯来克（VanSlyke）法定量测定氨基酸的基本反应。在标准条件下测定生成N2体积，即可计算出氨基酸的量，可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。,五、氨基酸的化学性质,1-氨基参与的反应,氨基酸与酰氯或酸酐在弱碱溶液反应酰基化，在多肽和蛋白质的人工合成中用作氨基保护试剂。,五、氨基酸的化学性质,（3）酰化反应,氨基酸酰化产物,取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高,1-氨基参与的反应（4）烃基化反应,鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。,五、氨基酸的化学性质,R=烃基,X=卤素（Cl、F）,常见试剂：2,4-二硝基氟苯（DNFB/FDNA），苯异硫氰酸酯（PITC）,与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,弱碱性,DNP-氨基酸,桑格（Sanger）反应，用于测N端氨基酸,与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,艾德曼反应（Edman）,上述第一个反应最早用二硝基氯苯与氨基酸反应，必须在碱性水溶液沸腾条件下才能反应。后来，英国生物化学家FrederickSanger改用DNFB，室温下就可反应。Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的NH2末端的氨基酸。1953年测定出胰岛素A链、B链的氨基酸序列，1958年获Nobel化学奖。1975年建立了快速测定DNA序列的加、减法，1976年又一次获NobelPrize.,上述第二个反应,1950年首先被Edman用于鉴定多肽和蛋白质的N-末端氨基酸。1967年，Edman和Begg建立了多肽的氨基酸序列分析仪。本反应的意义在于，肽链与PITC起反应，只有肽的N-末端氨基酸的PTH释放出来，对肽链的其余部分毫无影响。PTH经乙酸乙酯提取后，用层析法进行鉴定，确定肽链的N-末端氨基酸，剩余的肽链可以重复应用这个方法，测定其N-端的第二个氨基酸。重复多次就可以测定出多肽链N-端的氨基酸的排列顺序,1-氨基参与的反应,氨基酸的-氨基能与醛酮类化合物反应生成弱碱，后者是以氨基酸为底物的某些酶促反应的中间物（如转氨基反应）。,五、氨基酸的化学性质,（5）生成西佛碱（Schiffsbase）的反应,1-氨基参与的反应,（6）脱氨基和转氨基反应,用途：酶催化的反应。,五、氨基酸的化学性质,2-羧基参与的反应,五、氨基酸的化学性质,-羧基与碱或醇作用形成成盐和成酯反应，起到掩蔽羧基，活化氨基的作用。活化的氨基容易与酰基或烃基结合，因此氨基酸的酰基化和烃基化需要在碱性溶液中进行,成盐反应,掩蔽羧基，活化氨基,成酯反应,HCl气,（1）成盐反应和成酯反应,氨基被保护后，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，使羧基活化，使其容易与另一氨基酸的氨基结合，在多肽的人工合成中常用。,五、氨基酸的化学性质,2-羧基参与的反应,（2）形成酰氯的反应,氨基被保护的氨基酸,氨基酰氯,氨基酰化保护后，羧基酯化成甲酯，再与肼和亚硝酸反应生成叠氮化合物，可使羧基活化，常用于多肽的人工合成中,五、氨基酸的化学性质,2-羧基参与的反应,（4）叠氮化反应,代谢过程中酶催化的反应。,五、氨基酸的化学性质,2-羧基参与的反应（5）脱羧反应,氨基酸脱羧酶,味精的测定就是采用谷氨酸脱羧酶，测定CO2的量，从而确定Glu的量。,常用于氨基酸的定性或定量分析。,3-氨基和羧基共同参与的反应(1)与茚三酮反应,五、氨基酸的化学性质,蓝紫色化合物（脯氨酸反应物为黄色）,用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。,3-氨基和羧基共同参与的反应（2）成肽反应：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合成肽的过程。热力学上不能自发进行，可通过活化羧基方法使反应顺利进行,五、氨基酸的化学性质,很多侧链R基参加的反应是蛋白质化学修饰的基础：在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变，在蛋白质的结构与功能的研究中起重要作用,五、氨基酸的化学性质,4.侧链R基参加的反应：,半胱AA侧链上的巯基（-SH）反应性能很高，很容易被氧化，缩合成胱氨酸。二硫键（-S-S-）的形成是可逆反应，在稳定蛋白质构象上起很大的作用，氧化剂（氧化成磺基丙氨酸）和还原剂都可打开二硫键,SO3H,具有弱酸性，在较高pH条件下能够发生解离作用在弱碱性条件下能与卤代烃反应生成稳定的羟基衍生物能与各种金属离子形成稳定程度不同的络合物与硝基苯甲酸二硫化合物（DTNB）反应产物在412nm处有强烈吸收，可用比色法定量,羟基的性质丝氨酸和苏氨酸含有羟基可形成氢键；与酸形成酯蛋白质分子中，丝氨酸常与磷酸结合成酯丝氨酸还是大多数蛋白水解酶活性中心的主要组分，多种酰基化剂能与酶活性中心的丝氨酸羟基作用导致酶失活,咪唑基的性质组氨酸含有咪唑基，生理条件下具有缓冲作用组氨酸的一个重要特性是咪唑环一侧的去质子化与另一侧的质子化同步进行，能够发生多种化学反应，如磷酰化反应、烷基化反应等,甲硫基的性质甲硫氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核中心，容易与卤代烷等发生亲核取代反应形成烷基化产物,芳香环的性质苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸分子中都含有芳香环，是一个共轭电子体系这三种AA在紫外区有特征吸收峰，蛋白质的紫外吸收（280nm左右）性质主要来自它们的贡献可发生亲电取代，如碘化、硝化和重氮化反应等,六、氨基酸的分离分析,为了测定蛋白质中氨基酸的含量、组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，都需要对氨基酸混合物进行分析和分离工作。其方法较多，而目前使用较多的是层析法，依据是不同氨基酸的理化性质，尤其是溶解度和电离特性的差异。,一般原理：所有的层析系统都有两个相组成，一个为固定相或静相，一个为流动相或动相。混合物在两相中的分离决定于混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中进行分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数（Kd）。用下式表示：CA表示某一物质在动相中的浓度Kd=CB表示某一物质在静相中的浓度,（一）分配层析,分配层析,用载体固定固定相并作为流动相支持物，流动相向前流动过程中，溶质在两相依分配系数不断分配、流动，使得分配系数不同的混合溶质彼此分开的方法。,载体常用纤维素、淀粉、硅胶等,固定相常用水,流动相常用与水不互溶的、与载体无亲和力的有机溶剂,按载体的状态，分柱层析、薄层层析、纸层析等,层析柱中的载体都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。支持剂表面附着一层不会流动的结合水作为固定相，沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）是流动相。当用洗脱剂洗脱时，在柱上端的氨基酸混合物在两相之间按不同的分配系数进行连续不断的进行分配移动，逐步洗脱,分配柱层析,纸层析,固定相：纤维素上吸附的水流动相：展层溶剂，有机相层析时，混合氨基酸在两相中不断分配，疏水性强的氨基酸在固定相水中溶解度较小，与水的作用力也较小，随展层剂的展层（移动）也移动较远距离（迁