【毕业学位论文】（Word原稿）苎麻性别决定及相关基因的基础研究作物种质资源博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 博士学位论文 苎麻性别决定及相关基因 的 基础 研究 I 摘 要 苎麻是重要的纤维作物，且苎麻是多年生无性繁殖为主的异花授粉作物，杂种优势明显，杂种优势利用 潜力较大 。由于苎麻品种高度杂合性，苎麻杂种 性状严重分离 ； 另外由于苎麻是雌雄同株作物，杂种优势利用中需要隔离和去雄，费时费力 ； 这是长期困扰苎麻杂种优势利用的两大 难题。 再者，由于苎麻的杂合性，种子繁殖会造成后代的严重退化，生产中常用无性繁殖方法，但是无性繁殖成本高，速度慢，且 易 带病虫，这也是苎麻生产中遇到的问题。 苎麻的性别 决定 是苎麻杂交优势利用 及苎麻 繁殖方法 改进 的基础。 关于苎麻性别决定的研究，前人观察表明苎麻雄花序分化过程中先形成 雌雄蕊原始体，然后雌蕊退化形成雄花。而雌花中没有发现 雄 蕊痕迹。但是并没有给出雌雄蕊决定的准确时间，也没有外部形态标记 。 产生雄花的试验表明，花芽分化至雌蕊原基分化形成之前（花芽长度 右）比较容易诱导性转换 。但是此试验并没有给出 性别决定的确切时间点和 外部形态特征标记。外源激素与苎麻性别的关系的研究方面主要集中在性别逆转上。 关于苎麻性别决定相关基因方面的研究迄今为止未见报道。 本研究利用性别表达特异的材料， 对其植物学性状 、 生长动态 、 花芽分化 、 内源乙烯 、 苎麻乙烯合成关键酶（ 成酶） 基因 的克隆及时空表达特性等几个方面进行研究 ， 结果如下 : 1) 对性别表现特异的 雌株 苎麻 (雌雄同株 苎麻 (行田间 调查，发现 叶合生，茎黄绿色，花蕾绿色，茎斑细小且稀疏，而 柄绿色、托叶分生，茎绿色，花蕾黄白，茎斑大且密集。 2) 对 雌株 苎麻 (雌雄同株 苎麻 (行 生长动态调查，发现 麻期的株高日生长量逐渐降低； 在二麻和三麻期， 节位数 的日增加量以前期增加较快，后期增加减缓为主；叶长与叶宽生长动态与株高的生长动态相同，而且叶片的伸长与加宽是正相关的。 3) 对 雌株 苎麻 (雌雄同株 苎麻 (行 开 花特性调查 ， 发现苎麻第一花芽（最先分化的花芽）的性别决定整株的性别，即如第一花芽是雌性，则整株是雌株；如第一花芽是雄性则整株是雌雄同株。 4) 对 花芽分化进行显微切片观察，发现 第一 花芽大小 为 雌雄同株苎麻 性别决定期，此时总节位为 28； 第一 花芽大小为 株 苎麻 性别决定期，此时总节位为 24。 5) 对不同性别苎麻茎尖乙烯释放速率、不同性别苎麻材料不同节位花芽乙烯释放速率、 雌雄同株 苎麻 的雌花序、雄花序和雌 雄混合花序 的 乙烯释放速率 进行 测定， 同时对外施乙烯抑制剂（ 苎麻性别的控制进行研究， 表明苎麻性别分化与内源乙烯密切相关，高水平乙烯释放速率诱导 雌株 苎麻或雌花的产生。 雌株 苎麻在茎尖、叶和花芽中的乙烯含量都大于雌雄同株苎麻 。在雌雄同株苎麻中， 乙烯在雌花 序 中的含量高于在混合花 序 和雄花 序中的含量 。 乙烯抑制剂 以控制苎麻的性别表现， 以乙烯合成抑制剂 以 300 为最佳诱导剂浓度。 6) 通过比较几种 取试剂对 雌 花，果实，叶片，茎皮的总 取效果 ， 发现 I 可以 有效地提取苎麻不同组织的 质量很好，可以进行 抽提， 合成，下游实验。 7) 根据已克隆的双子叶植物的 苎麻茎尖总 过 合 增得到 615 列。对得到的 列在 对显示此序列是苎麻 成酶基因 ,编码 205 个氨基酸。苎麻 成酶基因推导的氨基酸与苹果、拟南芥、大豆、番茄、甘蓝、黄瓜、柑桔、烟草、桃的蛋白结构域的保守性分析显示含有 以报道的 成酶基因 5 个保守区。同源树分析表明，苎麻 成酶基因与大豆 成酶基因的同源性最高。 8) 实时定量 析苎麻 成酶基因的时空表达，发现在苗期以茎尖的表达量较高，叶片和茎杆次之，根中 最低 。在开花期和结果期，该基因的表达都比较低 。 （处于花芽分化后期 至 开花前期之间 ） ， 雌株苎麻（ 的茎尖 成酶的表达 量 是苗期茎尖的 ， 雌雄同株苎麻（ 的茎尖表达量 是 苗期茎尖的 而 对于花芽来说， 成酶基因表达 量 同样以 雌株 苎 麻高于雌雄同株苎麻， 它们分别是苗期茎尖的 。 综上所述，本研究在 植物学性状，花芽分化，内源乙烯、乙烯合成关键酶（ 成酶）基因以及苎麻 成酶基因时空表达特点与苎麻性别的关系等 方面取得了显著的新进展，对苎麻性别控制、杂种优势利用和改进苎麻繁殖方法 等方面具有重要的理论和实践价值。 关键词 ： 苎麻；性别决定； 成酶；时空表达；乙烯 L.) is is a be It be in by it is to on to by in to on on of in be by in .5 A3 of at in of on in of in In on in CC of as 1. in it 2. by of in in of in is is 3. of in of of by . If of if of 4. of by It of in 8t of in 45. in of in of in in in be by in is in In is in of to be by at a 00,100 at a 100, 300,500 of of at a 00 6. It is to NA to NA by NA be 7. a In CC of CR CR on NA of 15bp By CC 05 of CS in CS of CS of by 8. To CS at in of CS in in in CS in CS in or of of in CC a of V 目 录 摘 要 . I . 略词中英文对照 . 一章绪 论 . 1 第一节 植物性别研究进展 . 1 物的性别表现 . 1 物的性别类型分布 . 1 物性别的进化 . 1 物的性别决定 . 1 物性别决定时期的研究 . 2 性别决定机制的研究 . 2 别表达的标记 . 5 别表达的形态学标记和细胞学标记 . 5 别表达的生 理生化标记 . 5 别表达的分子标记研究 . 5 性别表达与激素 . 6 别分化与环境 . 7 性别表达与信号转导 . 7 第二节 苎麻性别决定研究现状 . 9 苎麻性别的分类 . 9 麻性别的进化 . 9 麻性别的决定时期 . 9 麻性别决定机制的研究 . 10 麻性别表达的调控 . 11 境与苎麻性别 . 11 素与苎麻性别 . 11 第三节 . 12 . 12 . 12 . 16 烯的信号传导与植物性别分化 . 16 第四节 本项目研究的目的和意义 . 18 1研究目的 . 18 2 研究意义 . 18 第二章苎麻不同性别材料形态学、生长动态和花芽分化研究 . 19 1 材料与方法 . 19 验材料 . 19 验方法 . 19 . 19 物学性状观察与生长动态调查 . 19 花特性观察 . 19 芽分化材料的固定和石蜡切片制片 . 20 2 结果与分析 . 20 同性别材料的植物学性状比较 . 20 同性别苎麻二麻，三麻生长动态 . 20 麻开花特性 . 23 同性别材料花芽分化的显微观察 . 24 3 讨论 . 26 第三章苎麻性别与乙烯的关系 . 28 第一节 内源乙烯与苎麻性别的关系 . 28 1 材料与方法 . 28 料 . 28 法 . 28 2 结果与分析 . 29 同性别苎麻内 源乙烯释放速率的差异 . 29 同性别材料不同节位花芽乙烯释放速率的差异 . 29 一性别材料不同性别单花序乙烯释放速率的差异 . 30 麻花芽、叶片和茎尖乙烯含量分布分析 . 31 麻花器官乙烯含量分布分析 . 31 3讨论 . 32 第 二节 两种乙烯抑制剂对苎麻性别及植物学性状的影响 . 34 1 材料和方法 . 34 . 34 . 34 2 结果与分析 . 34 . 34 理对苎麻植物学性状的影响 . 35 3讨论 . 36 第四章苎麻 . 37 第一节 苎麻不同组织总 . 37 1 材料和方法 . 37 . 37 . 37 总 取步骤 . 38 . 38 . 38 . 38 2 结果分析 . 39 种苎麻组织 . 39 . 39 . 39 3 讨论 . 40 第二节 苎麻 成酶基因 片断的克隆及生物信息学的初步分析 . 42 1 材料与方法 . 42 料，菌株，试剂 . 42 . 42 物设计 . 42 1.4 . 42 . 43 . 44 . 44 性克隆的酶切检测 . 46 粒的提取 . 46 切鉴定 . 46 . 47 2 结果与分析 . 47 麻 成酶基因片断的克隆 . 47 克隆与鉴定 . 48 源性分析 . 50 麻 成酶基因的多序列比对分析及分子进化分析 . 53 3 讨论 . 58 第三节 苎麻 成酶基因时空表达特性分析 . 59 1 介 . 59 原理 . 59 类型 . 60 光化学 . 60 2 材料与方法 . 61 . 61 . 61 2.3 . 61 时 标准化 . 61 时定量 . 62 3 结果与分析 . 63 苎麻不同部位，不同时期 . 63 时定量 . 63 成酶基因的 析 . 64 . 64 增产物特异性分析 . 64 . 65 4 讨论 . 67 第五章结论 . 69 . 69 2 论文主要创新点 . 70 3 今后研究的方向 . 70 参考文献 . 71 附 录 . 80 致 谢 . 84 作者简介 . 85 缩略词中英文对照 缩略词 英文 中文 1成酶 动蛋白 苄青霉素 基乙基乙烯基甘氨酸 基对 补脱氧核糖核酸 对照 代十六烷基三甲胺 碳酸二乙酸 种脱氧核糖核苷酸混合物 肠杆菌 化乙锭 二胺四乙酸 g of 力加速度的倍数 因特异引物 丙基硫代 D 半乳糖苷酶 B 培养基 使 国国家信息中心 密度 合酶链式反应 酸吡哆醛 of 速扩增 端 糖核酸 糖核酸酶 分钟转速 转录 二烷基硫酸钠 E 缓冲液 (羟 甲基 )氨基 甲烷 编码区 43 异丙基 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 第一节 植物性别研究进展 物的性别表现 植物的性别表现分三个层次即器官，植株和群体。单花的性别有三种类型：两性花，指一朵花内既有雌蕊又有雄蕊；雄花，指一朵花内只有雄蕊；雌花，指一朵花内只有雌蕊 (孟 金陵 等， 1995)。单株的性别有 7种表现：（ 1）雌雄同花：一株上只有雌雄同花的花；（ 2）雌雄同株：一株上既有雌花又有雄花。（ 3）雄株 ：全株只有雄花；（ 4）雌株：全株只有雌花；（ 5）雄花两性花同株：一株既有雄花又有两性花；（ 6）雌花两性花同株：一株上既有雌花又有两性花；（ 7）雄花雌花两性花同株：一株具有雌花，雄花，两性花 (et 1997)。在群体水平分为单性型和多性型两种，单性型个体间没有差异，多性型个体间有差异。单性型分五种：雌雄同花，雌雄同株，雄花两性花同株，雌花两性花同株。杂性同株（雄花雌花两性花同株）。多性型又分四种：雌雄异株，雄花两性花异株，雌花两性花异株，雌花雄花两性花异株 (孟 金陵 等， 1995)。 物的性别类型分布 在被子植物中，在植株水平上，两性花植物的比率约占 72%，雌雄异花同株的比率为 5%，而雌雄异株的比率为 4%，雌花两性花同株的比率为 3%，雌花两性花异株的比率为 7%，其它的比率为 9%(et 1997)。 物性别的进化 一般认为两性花是性别的原始类别，雌雄异株和雌雄同株是进化的高级形态，传统的进化观点认为，具两性花的杂性异株种类就是在这样的改变中演变为雌雄异株种类的 (许 智宏 等， 1999)，如图 1性花先进化形成雄花两性花同株、雌花雄花两性花同株和雌花两 性花同株，然后在形成 雄株、雌雄同株和雌株 。对于花的进化，也是从两性向单性进化的 （孟金陵 等 ， 1995）。 图 1物性别进化图 （ 孟金陵等， 1995） 物的性别决定 性别决定是植物生活循环中发生的发育决定，它导致两个组织或细胞的分化最终产生配子中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪 论 2 (et 1998；吕 柳新 等 ,1990)。在植物的生活史中 ,性别决定是一个重要的发育过程。这一过程在什么时候出现 ,什么部位发生以及如何进行 ,在不同植物 中有很大差异。 物性别决定时期的研究 植物性别的决定不仅仅是雌雄花原基分化为雌雄花的过程，还包含有雌雄配子发育的过程，在早期的研究大都集中在两性花原基选择性抑制雄蕊原基或雌蕊原基的发育，如吕柳新和陈景渌(1990)，林晓东和吴定尧 (1999)在显微水平观察到荔枝的单性花在花发育的早期均具有两性体原基，花的性别分化是在性母细胞减数分裂后，一部分花的雄蕊原基和另一部分花的雌蕊原基选择性退化的结果。有研究者对黄瓜的性别决定进行研究表明当黄瓜第 1片真叶展开，叶原基分化到第 9原基