【毕业学位论文】（Word原稿）豇豆种质资源遗传多样性分析及核心种质构建方法初探作物种质资源学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 豇豆种质资源遗传多样性分析及核心种质构建方法初探 I 摘 要 豇豆 是世界 上三大 食用豆类作物 之一，面积和产量仅次于菜豆和鹰嘴豆 ， 广泛栽培于热 带亚热带地区和部分温带地区，如：非洲、亚洲、南美洲、地中海盆地和美国南部。豇豆也是我国六大食用豆类作物之一。我国豇豆资源比较丰富，已收集的豇豆资源近 5000 份。本研究，在国内首次利用 物对 316 份来自于国内外的豇豆资源进行了系统的分析，并利用 记数据与形态性状数据，对豇豆核心种质的构建方法进行了初步探究。研究结果有助于国内外豇豆种质资源的收集 保护 、研究及 育种 工作。 主要研究结果： 利用 13 对 物 ， 对 316 份 参试资源 进行分析。检测到 47 个等位位点，每对 物2 等位位点，平均值 ，有 效等位基因平均 。国内外参试资源遗传多样性 指数 介于 物 于检测参试资源的遗传多样性最为有效。同时，对形态数据进行遗传多样性分析的结果表明，粒色 的 变异最丰富， 其次是 脐环色和荚色。 我国豇豆资源的遗传多样性较低，采用不同标记对不同省份普通豇豆资源遗传多样性进行分析，其变化趋势基本吻合。遗传多样性最丰富的省区是广西、湖北和内蒙古，遗传多样性最低的省区是安徽、山西、吉林和黑龙江。 本研究分别采用 记与形态标记对 不同省份普通豇豆资源之间亲缘关系进行分析，各省份资源 间的亲缘关系与地理位置关系 紧密。地理位置相邻省份资源间的遗传距离较小，亲缘关系密切；地理位置相距较远省份资源间的遗传距离较大，亲缘关系较远。采用 记对全部参试资源进行 图，结果显示国内、外资源差异明显，被划为 2 大类群；国内资源类亚组群 之间有一定的地理分布相关性 。利用受环境影响较少的 8 个形态性状对全部资源进行 图，结果表明国内、外资源间的差异不明显，组群间遗传差异与地理来源有一定的关系但不十分密切。将 记数据与形态性状数据整合，进行 图，结果表明国内、外资源差异明显，被划为 2 大类群，国内亚组群间遗传差异与地理来源关系较密切。以 记进行的聚类结果与以形态学标记进行的聚类结果中个体吻合性较低。 本研究在 记数据 类图，形态性状数据 类图，以及 将 据与形态性状数据整合进行 类的 基础上，以预定取样数目确定截距，划分类群，在每个类群抽取一份入选资源 ，从而构建了三套预选核心种质。对三套预选核心种质进行分析，抽取重复出现两次以上的资源 49 份构建核心种质， 取样比例为 16%，经检测此核心种质涵盖了 100%的位变异，具有很好的代表性；重复出现三次的 11 份资源构成微核心种质，取样比例为 经检测此微核心种质涵盖了 81%的 位变异，仍具有良好的代表性，更便于育种利用。 本研究中发现豇豆高代材料的遗传多样性狭窄，豇豆亲本材料的遗传背景亟待拓宽。 关键词： 普通豇豆，遗传多样性， 记，核心种质，形态标记 is of in .) .), it is in of is of in of is in ,000 to 16 SR of on SR in of as 1 13 to a 16 -7 SR a 7 in s to SR on At on of 2 SR of by SR 3 to of of in CA SR of to t of of to CA on SR SR on 4 on SR SR of 9 by in 6% 9 00% 1 by in 1 1% of is is in is 5 a 录 第一章 文献综述 . 1 遗传多样性概念及研究的目的和意义 . 1 遗传多样性与种质资源的概念 . 1 遗传多样性研究的目的意义 . 1 遗传多样性的研究方法 . 1 形态学标记 . 2 细 胞学标记 . 2 生化标记 . 2 分子标记 . 2 豇豆的概述 . 4 豇豆的起源 . 4 豇豆的分类 . 4 我国豇豆资源保存状况 . 5 国内外豇豆种质资源遗传多样性的研究进展 . 5 国内研究进展 . 5 国内研究进展 . 6 第二章 材料与方法 . 8 实验材料 . 8 试验材料 . 8 物 . 8 实验方法 . 8 形态性状调查与赋值方法 . 8 形态学标记数据统计分析方法 . 10 取与 记检测 . 10 数据记录与统计分析方法 . 10 第三章 结果与分析 . 11 豇豆种质资源 记遗传多样性分析 . 11 13 对 物的贡献率 . 11 豇豆种质资源 记遗传多样性分析 . 11 豇豆种质资源 记聚类分析 . 15 豇豆种质资源 记数据 析 . 22 豇豆种质资源形态学标记遗传多样性分析 . 23 不同形态 性状贡献率 . 23 豇豆种质资源形态标记遗传多样性分析 . 23 豇豆种质资源形态学标记聚类分析 . 27 V 豇豆种质资源形态标记数据 析 . 33 豇豆种质资源 记数据与形态学标记数据综合遗传多样性分析 . 34 13 对 物及 8 个形态性状的贡献率 . 34 豇豆种质资源 13 对 物与形态性状遗传多样性分析 . 34 豇豆种质资源 记数据与形态学标记数据综合聚类分析 . 36 豇豆种质资源 记数据与形态学标记数据综合 析 . 45 豇豆种质资源 记与形态学标记综合比较 . 45 豇豆种质资源 记与形态学标记遗传多样性指数比较 . 45 豇豆种质资源 记与形态学标记有效等位基因数比较 . 47 第四章 豇豆种质资源核心种质构建方法初探 . 49 核心种质 . 49 核心种质的概念 . 49 核心种质的构建 . 49 核心种质的评价 . 49 根据 记聚类结果构建预选核心种 . 50 根据形态标记聚类结果构建预选核心种 . 50 根据整合的 形态数据的聚类结果构建预选核心种质 . 51 豇豆资源核心种质的建立 . 52 豇豆资源核心种质的评价 . 53 第五章 综合讨论与结论 . 56 遗传多样性分析 . 56 聚类分析 . 57 育种亲本遗传背景 . 57 关于核心种质的构建 . 58 结论 . 58 参考文献 . 60 附录 . 64 致谢 . 73 作者简历 . 74 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 遗传多样性概念及研究的目的和意义 遗传多样性与种质资源的概念 遗传多样性 (指一个种群或者一个物种中，个体之间或群落之间遗传差异的程度，一 个位点上的等位变异组成该位点的遗传多样性，而所有位点的变异组成一个群体或一个物种的遗传多样性。这种变异是以空间和时间的形式构成的，既是生存和适应的基础，也是物种发生、进化、选择、重组和创新的物质基础（王洪新等， 1996； 1999）。即遗传多样性是一个物种或一个种群存在的遗传基础，一个种群遗传多样性越丰富，对环境胁迫的适应能力越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境，遗传变异的大小与其进化速度成正比。 品种资源是育种工作者用以选育新品种的原始材料，又称为种质资源。包括古老的地方品种、人工创制选育的 新品种和高代品系、自然形成的突变种和野生种。这些种质中蕴藏着各种性状的遗传基因，故又称为基因资源或基因库。在育种工作中，抗病、优质新品种的成功育成依赖于大量丰富、优异的原始材料的获得。即所收集种质资源具有丰富的遗传多样性，是快速、高效、成功选育新品种的物质基础和前提。由于人口剧增、环境恶化、品种更新等原因，正造成基因不断灭绝。一个基因一旦灭绝，便很难再生。因此，收集保存和评价利用作物种质资源已成为世界关注的热点。目前作物种质资源研究的宗旨是 “广泛收集、妥善保存、深入研究、积极创新、高效利用、共享服务、主权保 护 ”。 遗传多样性研究的目的意义 遗传多样性是作物种质资源研究的重要内容，它是用以衡量一个种、亚种或种群内基因变异性的概念，是维持物种长期保存和生物多样性的基础，是生物多样性的核心。一个物种遗传多样性越丰富，其进化的潜力就越大，或者说遗传多样性为物种的进化提供了潜在的原料储备。高度的遗传多样性是维持物种长期生存的基础，这是因为由单一纯合个体组成的群体对环境不断变化的压力不能有效地适应。人们发现很多灭绝或者受到威胁的物种有非常高的遗传纯合性，在相当程度上，它们的灭绝是遗传多样性的减小或丢失所引起 的。近年来，由于集中使用少数几个品种，排斥当地品种和野生亲缘种，造成遗传多样性丢失，多样性降低，基因库减小。因此，遗传多样性的研究，不仅可以揭示物种或群体的进化历史，有助于进一步分析进化潜力和未来的命运，也为人类保护作物的遗传多样性，开发利用生物界丰富多彩的遗传资源，促进经济发展和科学进步提供重要的保证和物质基础（张媛媛， 2005）。 遗传多样性的研究方法 遗传标记法是生物多样性研究的重要方法，根据检测技术的不同可以分为形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记（徐吉臣等， 1992；贾继增， 1996；刘勋甲等， 1998）。有用的遗传标记必须高度遗传，且基因型与环境之间的相互作用小（ 995； 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 et 996）。 形态学标记 形态标记（ 指生物的外部特征特性，可以观察到的性状，总体上可区分为质量性状遗传标记和数量性状遗传标记。它是最早被使用和研究的遗传标记，因为它表现直观，人们只要通过细心观察就可以将不同表型的个体区分开来。 形态标记方法简单直观，检测过程快，需要资金少。但研究 中很多看似不同的类型或个体在进化上可能有非常近的亲缘关系，这些不同的类型可能具有相同的基因位点，但只是等位基因的拥有频率不同，这样的不同类型很难通过形态性状加以区别。由于形态标记的遗传力低和难以确定其同源性，特别是不能准确的确定出特殊品系的遗传组成，因此不能完全适应种质资源研究的需要（ 992）。 细胞学标记 细胞学标记 (指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记 (979)，它们分别反映了染 色体结构上和数量上的遗传多样性。 染色体结构特征包括染色体的核型和带型。最初的细胞学标记主要指染色体的核型，包括染色体数目，大小，随体，着丝点位置等。而染色体显带是 20 世纪 60 年代后期发展起来的一项细胞学技术，它借助一套特殊处理程度，使染色体显出深浅不同的带纹，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。 细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择。有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料。某些物种虽然已有细胞学标记材料 ，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难，从而限制了细胞学的应用。 生化标记 生化标记 (要包括同工酶和储藏蛋白。主要应用于研究细胞分化，组织，器官的生长发育习性以及形态建成等方面，应用于研究鉴定各类植物种质资源的地理起源、分类等（ 990）。 近年来在植物遗传育种研究领域里，进一步研究了不同同功酶基因位点与植物的生物学特性、产量性状、抗病性、抗逆性以及产品的品质等数量性状、质量性状的连锁关系或相关性，同时还研究 了这些连锁关系或相关性在植物育种中的应用。目前同工酶已广泛应用于品种质量和纯度鉴定以及群体遗传结构的研究（ 997）。生物标记虽然具有一定的多态性，但其标记数目有限，无法满足大量遗传基础变异研究和辅助育种的需要。 分子标记 80 年代以来，分子生物学技术的快速发展为遗传多样性的检测提供了更直接、更精确的方法，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 即直接检测 列本身的变化。 析技术可以大致分为两类：一类是直接测序，主要分析一些特定基因或 段的核苷酸序列，度量这些片段 变异性；另一类是检测基因组的的 一批识别位点，从而估测基因组的变异性。直接测序是一件费时、费力、经济投入很大的工作，相比之下，对不特定基因组或 段识别位点的研究则十分普遍。由于 子标记的多态性丰富，核坩酸序列的多态性不受选择影响，因此是一种较理想的遗传标记（ 987）。分子标记的类型有许多种，下面重点介绍几种最常用的 子标记。 （）限制性片段长度多态性 ( 1980 年， 提出了 概念。其原理是利用限制性内切酶对不同个体基因组 泳分离产生多态 段 ，最后与同位素或非同位素标记的探针杂交，从而显示与探针同源序列的酶切片段在长度上的差异（ 989）。 优点在于它可以区别纯合基因型和杂合基因型，能够提供单个位点的较完整的资料，探针极多，目前各种主要作物上筛选的探针多达数千个，因此它检测的遗传位点也非常之多。但是由于 繁琐操作步骤，使得其实验费用昂贵，而且探针是进行 前提，析的效率更依赖于合适探针的获得。同时由于操作中要用到限制性内切酶，因此对 需样品量也较大，因此在对涉 及许多个体的居群遗传变异进行分析时，这种方法通常不被采用。 （）随机扩增多态性 以 基础的分子标记技术，基本原理是采用 10 个碱基（随机序列）的寡核甘酸为引物，该引物的基因组 许多个结合位点，当两个结合位点之间的 段长度符合应条件时即可被扩增。不同来源的 有不同的 物结合位点，从而在 应中获得不同的扩增产物，再经凝胶电泳分离， 色后即可观察(990;990)。 技术优点是： 1、 合成一套引物可以对没有进行任何分子生物学研究的物种进行 具种属特异性。 2、无需制备克隆、标记探针、 交，简单迅速，成本低。 3、样品用量少，灵敏度高。 术的缺点： 产生显性标记（即有或没有），所以不能用来鉴定杂合体，但对自交系和回交群体来说是不成问题的，因为所有或大多数的基因位点都是同源的。 不能单独的用来对没有基因标记的生物进行遗传图谱的分析，因为它所产生的多态性是随机的。 （） 扩增片段长度多态性（ 由荷兰科学家 展起来的一种检测 态性的新方法。它是将 可靠性和 高效性完美结合起来。它的原理是基于对植物基因组总 酶切，经 增后的限制片断进行选择。它的特点是结合了 优点，多态性高，实验结果稳定可靠，而且再现性高，重复性好，是一种检测遗传多样性的理想方法。限制性酶和引物的选择可能直接影响到可检测的 多态性。与 似， 以在对所研究材料分子生物学背景无任何了解的情况下获得大量信息。但是这种方法实验步骤复杂繁琐，费用相对中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 昂贵；操作难度较高，要求 实验者对该实验操作较为熟练；对酶切用的 板的质量要求较高（吴敏生等， 1998）。 （）微卫星 称简单重复序列（ 记，重复单位很短，只有 1复数可变，总长度为几十个 布于整个基因组的不同位置上。微卫星 端的序列一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计特异引物进行 扩增串联重复序列，根据串联重复数的不同，揭示微卫星 长度多态性。其特点是：共显性、多态性强、可通 过 速检测，引物序列公开发表后，便能广泛交流使用。是构建初级遗传连锁图谱非常有效的分子标记。缺点是必须依赖于微卫星两端序列设计引物。目前， 记技术已广泛的应用于遗传连锁图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种子纯度的检测、种质分类和遗传多样性的研究和亲缘关系的鉴定等 (方宣钧， 2000；李明芳， 2004)。 豇豆的概述 豇豆属豆科 (蝶形花亚科 (豇豆属 (. )，一年生草本植物，学名 L.)别名豆角、角豆、长豆、裙带豆、饭豆、蔓豆、泼豇豆、黑脐豆等，英文常用名为 色体 2n 2x=22(郑卓杰， 1997)。 豇豆是热带和亚热带发展中国家必需的作物，尤其是在非洲、亚洲、美国的中部和南部。作为一种食用豆，豇豆的蛋白含量高，并且在它幼嫩的叶子、豆荚、种子中也含有维生素和矿物质。2005 年全世界豇豆 栽培面积 10 457 000 产 3 697 000 t， 仅次于菜豆、鹰嘴豆，在全部 20多种食用豆类作物中排第 3 位（ 2006），豇豆 是世界上主要的食用豆类作物， 也是我国 六大食用豆类作物