【毕业学位论文】（Word原稿）水稻功能候选基因RNA干涉载体的构建及其应用作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 水稻功能候选基因 涉载体的构建 及其应用 I 摘 要 涉 (术是通过双链 介导特异性地降解相应序列的而导致转录后水平的基因沉默。 该技术 已被广泛应用于植物基因功能研究。与其他技术相比， 涉技术具有特异性强、沉默效率高等优点。 本文应用 术进行水稻功能候选基因 涉表达载体的构建，并进行遗传转化研究。 术是通过多重载体 ， 高效构建目标基因及任何 段克隆载体和表达载体。该技术 以 噬菌体的位点特异性重组体系为基础，两端具有位点的 段 或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上。 本 文采用 术体系，以水稻 细胞 程序性 死亡相关功能候选基因 目的基因， 从中 选取目标区段进行 涉表达载体的构建，经过 增、应 、 应后，成功构建了 三个 水稻功能候选基因的 涉 双元表达 载体 ，为大规模构建水稻功能候选基因 体打下了基础 。 构建完成的载体通过农杆菌介导法转化籼稻 过共培养、筛选培养、预分化培养、分化培养 等获得 122 株 转基因植株。 同时在 转基因 过程中对 籼稻 伤组织诱导、分化以及农杆菌转化水稻的各个参数进行优化。 关键词 ： 涉，候选基因，细胞程序性死 亡 ， 化 NA is of by of is an to be to of in to is In is to to in to is a of or NA It is on by . or by be CD as NA CR to P R to by of 录 第一章 文献综述 . 1 物功能候选基因的分析策略 . 1 找功能候选基因 . 1 能候选基因的验证 . 7 物细胞程序化死亡相关功能候选基因 . 11 物 究概况 . 11 物 基本特征 . 11 物 关基因 . 12 稻 关基因 . 13 涉技术及其在基因功能研究中的应用 . 14 涉现象的发现过程 . 14 涉的分子机制 . 15 涉的特点 . 16 物 涉载体特征 . 17 用 术构建 涉载体 . 17 的和意义 . 18 第二章 构建水稻功能候选基因的 涉载体 . 20 料和方法 . 20 稻材料 . 20 剂 . 20 涉区段选择 及引物设计 . 20 提取籼稻 . 20 . 21 物的琼脂糖凝胶电泳 . 21 化回收 物 . 21 P 反应 . 22 R 反 应 . 24 达克隆转化农杆菌 受态细胞 . 25 果与分析 . 26 涉区段选择与 物设计 . 26 稻总 测 . 27 物琼脂糖凝胶电泳检测 . 27 P 反应阳性克隆检测 . 27 达克隆转化农杆菌 . 30 第三章 涉载体对籼稻 遗传转化 . 33 料和方法 . 33 料和试剂 . 33 杆菌介导的水稻遗传转化 . 33 转化条件的优化 . 35 果与分析 . 36 愈率以及愈伤生长状态的研究 . 36 高愈伤组织分化频率的研究 . 37 霉素筛选浓度的确定 . 38 第四章 讨论 . 40 涉载体的构建方法 . 40 响 涉效率的因素 . 41 用 术构建 涉载体注意事项 . 41 第五章 结论 . 43 参考文献 . 44 附录 涉载体示意图 . 50 附录 水稻转化组织培养图片 . 52 致谢 . 54 作者简历 . 55 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 涉 链 干扰 末端重复序列 胞程序性死亡 因表达系列分析 制消减杂交 达序列标签 录后基因沉默 赖性的 合酶 导沉默复合物 夹 乙二醇 碳酸二乙酯 合酶链式反应 酰丁香酮 乙酸 6动素 2， 4,4， 4 落酸 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 物功能候选基因的分析策略 在遗传学研究中，根据生物功能或图谱定位，把任一假定导致性状变异的基因称为候选基因（于澄宇等， 2004）。当一种 与 目标性状相关的生化或生理途径已知时，根据其在表型变异中所起的作用，可以选择已 经克隆的相关基因作为功能候选基因。如果还不知道该物种的基因或其列，还可以尝试用其他物种的序列作为参考序列，来推断保守区域，设计简并引物，进行 增，得到功能候选基因（ ， 2001）。 功能候选基因的研究主要有两个步骤：首先寻找功能候选基因，根据分子结构或基因差异表达研究的结果，确定相关功能候选基因。然后进行遗传转化、生理 、 生化 、 分子生物学实验来验证功能候选基因。 找功能候选基因 过突变体选择功能候选基因 突变体是某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基 因发生突变的材料。植物的表型突变是由相应的基因的突变造成的，该突变基因即为相应突变表型的功能候选基因，就可以用正向遗 传学和反向遗传学方法进行基因功能鉴定。构建饱和的基因突变群体， 是 大规模分析鉴定基因功能的直接有效的方法。水稻突变群体的构建方法主要有自发突变、物理诱变、化学诱变、插入突变等。 发突变 自发突变 是 在自然环境下发生的遗传信息的变异或突变，是生物变异的重要来源，也是自然进化的基础。自发突变为人类提供了极有价值的遗传材料。在水稻中，矮秆突变株的发现揭开了矮化育种的序幕 ； 细胞质雄性 不育株的发现使水稻三系法杂种优势的利用成为现实 ； 而光 （ 温 ）敏核不育株的发现则为采用两系法利用水稻亚种间的杂种优势铺平了道路。但自发突变的突变率低，一般少于 而且许多突变通过表型无法鉴定而丢失，很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株 ， 要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的，需要进行系统的普通遗传学分析、突变性状的精细定位，再通过图位克隆法才有可能分离到相应的突变基因。如水稻半矮秆突变体在上个世纪 50 年代就已发现，但直到 2002 年才报道已利用图 位 克隆法分离到这个基因（ 2003； ， 2002 ； ， 2002） 。 理诱变 物理诱变中主要是通过辐射产生突变体。常用的电离辐射主要是 射线、紫外线、 及 粒子、质子及中子等。物理诱变中，快中子被认为是植物中相当有效的突变剂 （ 982） 。由于快中子轰击往往导致缺失突变，相应的突变基因可以用基因组相减的方法分离 ， 基中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 因的功能可依据突变表型加以鉴定。水稻大部分以处理干种子为主，不需要进行转基因操作，大量突变体的获得简便易行。 2001b） 还构建了包含 24 660个 突变体的水稻快中子突变群体 ，并对 5个基因位点进行筛选，结果也筛选出 1个基因位点的缺失突变体。 学诱变 化学诱变就是通过化学诱变剂处理植物 （ 通常是种子 ） 来诱发突变。化学诱变剂的种类很多，可分为 4类 ： （ 1） 碱基类似物及有关的化合物， 如 5尿嘧啶、 52嘌呤和8（ 2） 抗生素，重氮丝氨酸、丝裂霉素 （ 3） 烷化剂 ， 如 甲基磺酸乙酯 （ 、 、乙烯亚胺、亚硝基乙基尿烷和亚硝基乙基尿 ； （ 4） 其他种类的诱变剂， 如 亚硝酸和吖啶。目前，使用较多的化学诱变剂是 效的诱变剂，已广泛应用于水稻等植物的诱变育种。 到 而导致 C/，产生点突变。 利用点突变可以精确鉴定基因的功能，在基因功能鉴定上有着独特的优势 ， 但由于点突变不易鉴定，在功能基因组学上的应用受到限制。近年来，单核苷酸多态性筛选技术的成熟为鉴定点突变奠定了基础。在此基础上， 2000） 建立了一个用于大规 模筛选点突变的方法n ，可以大规模的筛选突变体。 2007）分别用 得两种点突变群体。对于 10个目的基因，运用 7个核苷酸突变，在 0个核苷酸突变。 入突变 将某些元件插入到水稻基因组中后，相应位点基因的表达就可能受到抑制 ， 插入元件同时又可用作标签 ， 从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。 目前 ， 水稻中最为常用的插入元件主要是 座子及反转录转座子等。 随着农杆菌介导的水稻转基因技术的不断完善 （ 1994） ， 旦获得 可以 将 1991） 。 点是基因组 且 可以建立饱和的 座子插入突变 转座子 （ 是染色体上一段可移动的 可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到 恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。用转座子引起 突变的转座子 突变株的基因组文库中钓出含该转座子的 获得含有部分突变株 而以该 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。目前已应用于水稻插入突变库构建的只有 座子 。 转录转座子插入突变 逆转录转座子的增殖和转座子均以 过 及逆转录过程，因而被称为逆转录转座子 （ 。逆转录转座子的主要特征是两端具有长的同向末端重复序列 （ 。 正常条件下它们是失活的。由于逆转录转座子通常只引起稳定的突变，因此用常规的遗传分析方法，很难区分逆转录转座子引发的突变和其他因素引起 的变异。 1996） 建立了水稻逆转座子 1999） 利用这些逆转座子 异表达基因可作为功能候选基因 在植物不同的组织中，表达的基因是不同的。在不同的外部条件下，表达的基因也是不同的。通过分析同一种生物不同组织，不同处理之间的差异表达基因，可以找到特异性表达的基因。这些基因必然承担着特殊的功能，可以把这些差异表达基因作为相应的功能候选基因。常用的分析基因差异表达的技术有 异显示技术、抑制 消减杂交、基因表达系列分析、表达序列标签、基因芯片等。 1992年，哈佛大学的两名科学家 和 根据高等生物成熟的 A） 的特性创立了 1992）。 小部分 组蛋白 带有 3 的结构，设计 3端引物 M、 、C、 G、 T，其中 ），这样有 12种引 物，称之为锚锭引物。 术就是利用这种锚锭引物将 实验 中 不同来源的细胞或不同状态的同种细胞的总 用此引物和 5端的随机引物及含放射性同位素标记 行 色或放射自显影，找出差异表达 胶上切割下这些差异性条带，用相同的引物和条件进行 隆所得 测出的序列与基因序列数据库中的序列作同源比较，即可知分离的是已知基因还是未知基因。或可用作探针从 筛选到全长的 1）原理简明且操作方便。主要依靠 化了实验操作并使鉴定低丰度的 2）灵敏度高。用量很少的 3）可以同时比较两种以上的 用于鉴定某一过程的基因，而不仅仅是某一细胞系所特有的基因。（ 4）快速、重复性好。约90%条带都可以重现，更重要的是该方法每一步的结果都可以检验。 因克隆的强有力的工具，但实际中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 应用中仍有一定的局限性，主要表现在：（ 1）所得的特异性 时甚至高达 50%（ 2）初步获得的 为 300往往是 3端的非翻译的编码序列，使上游的表达信息得不到检测。因此，这对利用 且在 3） 取决于引物与模板之间的特定匹配情况。这样即使是高丰度的 于引物与之匹配不合适 ， 使扩增产物量少于丰度虽低但引物匹配良好的模板扩增出的量，从而导致对基因表达差异的错误认识。（ 4）由于此项技术主要利用 此需要在 板用量、引物、 度、退火温度等方面进行改进，使达到较好的扩增效果。 王洁等（ 2005）以白叶枯感病材料 用 近等基因系在接种白叶枯病菌前后基因表达的差异，共获得了 16个差异片 段 ，其中 15个来自抗病 近等基因系。通过反向 定出一个差异表达片 段 。进一步分析表明，该 片段 是受白叶枯病菌诱导表达的片 段 。 2007）运用 处理（ 12 ）和对照（ 30 ）的水稻幼穗的 5000个转录本中分离出了 123个差异显示基因。其中 8个克隆被证实为冷胁迫相应基因。 制消减杂交法 抑制消减杂交法（ 一种以抑制 1996）。抑制 法与引物配对而选择性地抑制非目标序列的扩增。 取两个待分析样品的 或 酶切，形成驱动子 测验子 自连上不同的接头（ 52， 54），将过量的驱动子 测验子 一次杂交后，合并两份杂 交产物，与新的变性单链驱动子 交产物中除第 1次杂交产物外，还产生一种新的具有两端接头的双链分子。用根据两个接头设计的内外两对引物进行巢式 含两个接头的目的片段以指数形式扩增，其余片段或者没有接头序列或含相同接头的长反向重复序列在退火时产生一种特殊的二级结构而无法与引物配对扩增，或者只含单个接头而呈线性扩增。经过两次杂交两次 的片段就得以富集分离，酶切去除接头的目的片段经 可用作探针从 基因） 。 抑制消减杂交具有以下优点：（ 1） 2）假阳性大大降低。（ 3）背景低，重复性强。（ 4）速度快，效率高。在一次 以同时分离成百个以上的差异表基因。（ 5）具有组织特异性， 得该技术在 差异表达基因方面更为通用。 抑制消减杂交的缺点如下：（ 1） 2）所需中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 起始材料量相对较多（ （ 3）较多依赖 4）不能同时进行数个样品或不同样本之间的比较。（ 5）非酶切位点区域内的点突变，小缺失或插入均不能被有效的发现。（ 5）得到的片段尚需扩增 其全长 ，筛选过程繁杂。 刘军等（ 2000）利用 们以水稻茎尖分生组织（ 对照群体，幼穗分生组织（ pb/目标群体，进行抑制消减杂交。通过差示筛选鉴定了 40个在（ pb/特异表达或表达增强的侯选克隆。 少 40%的侯选克隆代表了在 pb/时，相当一部分克隆为低丰度转录本。对 40个 测序后，与 果表明 ： 2个克隆为已知水稻基因； 11个克隆与已知基因的同源性为 60% 90%；另有 18个克隆在 称为 因，分析可能代表了新基因，或是由于序列位于变异丰富的 3端，故而无法查到与其他物种的同源性。序列同源比较的结果显示大部分 袁红雨等（ 2004）为了分离受褐飞虱取食抑制的水稻基因，采用抑制消减杂交方法，以正常生长的水稻幼苗为目标群体，以褐飞虱胁迫 32小时 的水稻幼苗为对照群体，构建了含 200个重组质粒的 机挑选 50个重组质粒进行反向 经过 到 2个受褐飞虱取食抑制的基因。 徐锋等（ 2006）利用抑制性消减杂交技术成功构建了植物激活蛋白处理水稻与非处理组水稻中差异表达的消减 文库中一共筛选到 1756个克隆 ， 通过反向 中得到 264个有效克隆并测序，利用 得 28个上升表达差异基因。通过分析这些基因与 植物的光合作用、营养物质的运输代谢等多种植物的生理生化功能相关。本研究为揭示激活蛋白的作用机理奠定基础。 因表达系列分析法 基因表达系列分析技术（ of 995年首先提出的，并逐渐发展成为一种以测序为基础，用于全基因组表达频率分析和寻找差异基因的新技术（ 1995）。该技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因，获得这些基因表达丰度的数量信息，还可比较不同组织、不 同时空条件下基因表达的差异 。 端短区域为基础。该技术主要依据有两个：第一，来自转录物内特定位置的 9含有的信息足以代表其相应的转录物；第二， 增并集中在 1个克隆中测序，标签重复出现的次数代表该转录物的拷贝数。根据其占总标签数的比例即可分析出其所对应的编码基因的表达频率。 1）提取 生物素标记的寡核苷酸（ 引物反转录合成 锚定酶（ 酶切 ，通过链霉亲和素蛋白珠（ 集 端部分，将其作为该转录物的独特信息。（ 2）将所得的 别与含标签酶（ 点的接头 连接。这种标签酶是典型的 类限制酶，能在其不对称识别位点上游的 20 生平末端。（ 3）用标签酶酶中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 切产生连有接头的短 约 9混合 并连接 2个 短 构成双标签 （ 后 ，以引物 进行 4）用锚定酶切割扩增产物 ， 分离双标签并克隆、测序。（ 5）对标签数据进行 与 得转录物丰度的数据信息及新的表达基因示意图。 1999）用 个样本各抽取 2000多个标签作比较。结果表明，水稻幼苗在不同的生理状态下，大多数转录片段的表达处于同样的水平。但有 24个转录物表达处于显著不同的水平，其中有 8个基因（包括 6个 与水稻 受厌氧诱导产生的，而有 6个基因则为缺氧抑制表达。在测得的这些基因中，大多数是以前并不知道与厌氧有关的。将这些基因作为水稻厌氧功能候选基因，对这些基因进行表达研究和功能分析，将有可能揭示出水稻对厌氧胁迫作出反应的机制。 达序列标签 长约 150后从 其进行一轮大规模测序所获得 的部分 或 3端序列。这些序列即可特异性代表生物体某种组织某个时期的一个表达基因。 基因的表达过程是 剪接去除内含子后再经翻译产生有功能的蛋白质。绝大多数真核生物 5端转录非翻译区）， 放阅读框架）， 33端转录非翻译区，包括 3部分组成，其 般说来， 5每条 端或 3端的有限序列 可 以 特异性代表生物体某种组织某个时期的一个表达基因。再者，一个基因的表 达次数越多，能够测到的相应 以通过 1994）构建了盐胁迫、氮缺乏等胁迫条件下的水稻悬浮培养细胞 机挑取了 780个克隆进行测序，分析结果发现许多基因与胁迫相关，一些基因与信号转导有关，为了检测 研究还分析了在 20%蔗糖、盐胁迫、冷胁迫和氮缺乏状态下，参与 果表明，为了维持水稻细胞的动态平衡，一些关键基因在不同的胁迫条件 下，同时被诱导表达了 ，继续 能量 的合成代谢。 1995）随机挑取了 500条来自胚乳 端测序，发现 153个克隆（ 为已知基因，其中 克隆编码种子储藏蛋白，其中编码谷醇溶蛋白和谷蛋白的基因冗余度最高；同时发现水稻胚乳阶段与种子储藏蛋白和淀粉合成相关的基因表达水平明显高于水稻其他生长发育时期。 因芯片 基因芯片（ 又称 是最常见的生物芯片之一。基因芯片技术是指将许多特定的寡 核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成 后与待测标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 光信号作出比较和检测，从而迅速获得所要的生物信息（ ， 1997）。 基因芯片技术是目前最为有效的基因表达分析手段。来自实验组和对照组的 此过程中分别标记不同波长的 绿 ） 或 红 ） 荧光染料，等量混合之后与芯片上的 激光扫描仪从 两个颜色通道检测杂交后芯片上每个探针位点的荧光强度，某个探针位点在特定通道下的荧光强度值反映