【毕业学位论文】（Word原稿）北京地区野生大豆（G. soja）遗传多样性研究作物种质资源学硕士论文

密级： 论文编号： 中 国农业 科学院 学位论文 北京地区野生大豆（ G. 传多样性研究 on in on in I 摘 要 野生大豆（ 栽培大豆（ G. 野生祖先种 , 为栽培大豆的遗传育种和种质改良提供了重要的基因资源。北京地区是我国野生大豆分布区中部。近些年，北京地区经济迅速发展，人口急剧增加，一些因素破坏了野生大豆的生存环境，使宝贵的资源在逐渐流失。因此本文对 北京地区的野生大豆进行考察和遗传多样性的研究，为考察、设立原位点保护、制定合理的取样保存方案、研究和利用提供理论依据。 本文通过实地考察，收集北京地区野生大豆 10 个居群，每个居群 30 个单株（居群 2 为 28个单株），共 298 个单株。分别从形态水平和分子水平上对北京野生大豆群体进行了遗传多样性分析。采集的种子进行田间种植，共调查了 11 个形态性状（ 7 个数量性状和 4 个质量性状）；实验室内分析共采用了 40 对 物，平均每个连锁群上 2 对引物。分析结果表明： 1、 质量性状多态相对单一； 居群内个体间的 数量 性状值相差很大 ， 居群间数量性状的平均差异大小有 一定的 地理分布性 ，但各性状差异表现不尽相同。 性状变异系数大小顺序依次为： 叶片长宽 单株 产量 地上部茎叶干重 生长速率 株高 百粒重 播种至开花天数 。数量性状的多样性指数高于质量性状的多样性指数。 数计算表明 北部山区指数最高，为 次是中 低是东部山区，为 1 号居群的 数 最高， 9 号居群多样性最低。 通过聚类分析，把北京地区 10 个居群分为 4 组。 2、 利用 40 对 物研究了北京地区天然野生大豆居群的遗传结构与遗传多样性 。 10 个居群共检测到 526 个等位变异，平均等位基因数 (A)为 ，平均有效等位基因数 ( 群平均 数 (I)为 均期望杂合度 ( 均基因分化程度 (群内遗传多样度 ( 群间遗传多样度（ 京天然群体平均多基因位点杂合度 ( 本研究显示中 在地理上，环绕北京地区的太行山和燕山两大余脉区域野生大豆居群遗传分化表现出地理差 异。我们看到一个可能是经过自然选择而形成的有抗旱潜力的居群在遗传上表现单一化。期待该居群提供耐旱基因利用。 关键词 野生大豆 (遗传多样性，北京， 子标记 is as of G. As is an In of of of in to in of we of of 0 28 98 We in 1 A 0 SR of to as 1. of in a in V of as 100to of of of o.1 of o.9 on 0 2. 0 526 in of A) of a of to of in of A to is in of s) 录 第一章 绪论 . 1 传多样性 . 1 究遗传多样性的意义 . 1 传多样性研究方法 . 2 传多样性的度量参数 . 4 生大豆 . 7 生大豆 . 7 生大豆的地理分布与生境 . 8 生大豆的考察保存状况 . 9 生大豆的利用价值 . 9 内外研究现状 . 10 生大豆生物学方面研究 . 10 生大豆生理生化研究 . 11 生大豆与进化的关系 . 13 生大豆遗传多样性研究 . 14 第二章 形态性状、分布及遗传多样性 . 16 然居群取样 . 16 居群的地理分布及生境 . 16 间种植 . 18 状记载及标准 . 18 据整理与分析方法 . 18 果与分析 . 19 态性状类型及变异 . 19 量性状变异系数 . 20 群内形态类型分布 . 23 群形态性状多样性分析 . 26 群形态性状聚类分析 . 27 论 . 28 京地区野生大豆形态性状多态 . 28 群中数量性状的变异程度大小和生长环境的关系 . 29 京地区野生大豆资源保护建议 . 29 第三章 子标记分析遗传多样性 . 31 验材料 . 31 验方法 . 31 提取 . 31 增作用引物 . 32 增程序 . 33 丙烯酰胺凝胶电泳检测 . 33 据处理 . 34 据统计 . 34 传多样性参数分析 . 35 类分析 . 35 坐标分析 . 35 果与分析 . 35 点多态变异 . 35 传多样性指数分析 . 36 群的遗传结构 . 37 体的基因分化 . 38 群间遗传聚类分析 . 39 群间的主坐标分析 . 40 论和讨论 . 41 京地区天然野生大豆居群基因分化与遗传差异 . 41 理环境对遗传结构的影响 . 41 群地理分布与遗传结构及分化的关系 . 41 源保护策略与利用 . 42 第 四 章 形态标记与 分子标记分 析的结果比较与讨论 . 43 形态性状和各位点在居群上的遗传变异 . 43 传多样性指数分析 . 43 群间遗传聚类分析 . 44 第五 章 全文结论 . 45 参考文献 . 45 附录 . 52 致谢 . 53 作者简历 . 55 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 氧核糖核酸 糖核酸 信使核糖核酸 合酶链式反应 单重复序列 机扩增的多态性 制性酶切长度多态性 增的限制性片段长度多态性 A of 均等位变异数 he of 效等位变异数 均期望杂合度 际观察杂合度 I 农多样性指数 六烷基三甲基溴化铵 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 传 多样性 当今世界面临人口、资源、环境、粮食与能源五大危机，这些危机的解决都与地球上的生物多样性密切相关。因此。保护生物多样性已成为国际社会关注的热点。 1992 年在里约热内卢召开的联合国环境与发展大会上， 153 个国家的首脑共同签署了生物多样性公约。我国作为生物多样性公约的缔约国，正在积极执行这一公约，生物多样性的保护和研究已在我国蓬勃开展 （董玉琛， 1995）。 遗传多样性（ 生物多样性的核心，是物种多样性、生态系统多样性和景观多样性的基础。广义的遗传多样性是指地球 上所有生物携带的遗传信息的总和，而狭义的遗传多样性是指种内不同群体之间或同一群体内不同个体的遗传变异的总和（钱迎倩等， 1994）。一般说遗传多样性是指种内的多样性，即种内的遗传变异。 究遗传多样性的意义 遗传多样性研究是植物资源合理保存和利用的理论基础。我国存在着复杂的地势土壤和气候条件，加上多民族各种各样的耕作制度，因而作物种类、品种和类型非常丰富。由于农业生产中，过于强调高产品种的推广和外来品种的引进以及优良亲本的重复使用，已导致作物品种遗传基础狭窄，甚至使不少品种和类型丢失 。 此外由于人口 剧增，环境恶化，一些宝贵的野生资源也在逐渐消失，在我国大豆育种上品种遗传基础狭窄的危害性已开始显现出来（田佩占等， 1998）。因此有必要对作物遗传资源进行保护。只有掌握物种的遗传多样性水平高低、群体的遗传结构及其与环境条件的关系，才能制定科学有效的保护策略和措施来保护人类赖以生存的遗传资源（基因），来挽救濒于绝灭的物种及其遗传多样性 ,否则，任何物种水平上的保护活动都可能成效不大。 我国野生大豆分布非常广泛，拥有量占全世界的 90%，是宝贵的资源。但由于人类建设，农田用地及环境污染等因素，目前面积在逐渐缩小。我 们虽已在全国范围内搜集过，抢救了一批资源，但由于人力物力有限，所以要有选择的保存种质，适当的设立原位保护点。遗传多样性的研究可以为搜集考察及原位保护点的设立提供理论依据。 研究遗传多样性有助于进一步探讨生物进化的历史和适应潜力。一个物种的遗传多样性水平高低和其群体遗传结构是长期进化的结果，遗传多样性越高或遗传变异越丰富 ,对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境，理论推导和实验证据证明，一个物种遗传变异水平的高低与其进化速率成正比。因此对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史（起源 的时间、方式），也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料（ ， 1991），遗传多样性是生物起源研究的一个最重要最直接的证据（中国科学院生物多样性委员会， 1994） 。 栽培大豆起源于中国，这是世界公认的观点，但大豆究竟起源于中国何处众说不一。现在较为流行的学说有东北起源学说、北方起源学说、长江流域起源学说、黄河流域起源学说及多中心起源学说（徐豹等， 1986； 李福山， 1994；周新安等， 1998；王连铮， 1985）。徐豹等（ 1995）和庄炳昌等（ 1996）根据中国野生大豆资源目录分析了中 国所有野生大豆资源一些性状的基中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 因频率与地理分布规律，发现黄河中下游地区，中间类型大豆资源最丰富，变异类型最多。因此有理由认为该地可能是栽培大豆的起源地之一。 英山）等（ 2001）等采用群体遗传学方法，研究分析了 6172 份中国野生大豆资源的数量、遗传多样性指数（ 数）、 12 个性状的综合变异系数及其地理分布，根据 种作物都有一个独特的多样性初生中心 ,这也就是它的起源中心 ,这种中心往往在进化的起始阶段就扩散到较大的区域 ,其分布是地理学上的连续统一体 ”（ ， 1973）的理论，提出了中国野生大豆遗传多样性中心及多样性扩散，据此推测了中国野生大豆的起源模式，为栽培大豆的起源提供了一个重要依据。 传多样性研究方法 检测遗传多样性的方法随生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善，然而目前任何检测遗传多样性的方法，或在理论上或在实际研究中都有各自的优点和局限，还找不到一种能完全替代其他方法的技术（ ， 1991）。 （ 1）形态学水平 从形态学或表型性状上来检测遗传变异是传统的也是最简便易行的方法。通常所利用的表型性状主要有 两类 ,一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状（如质量性状、稀有突变等） ,另一类是由多基因决定的数量性状（如大多数形态性状、生活史性状）。在天然居群中，单基因 性状 较少，相对而言，应用数量遗传学的方法研究数量 性状 的变异更为科学和严密，它可以将数量 性状 变异的遗传因素与环境因素区分开来，还可以估算数量多基因位点数目。它估算的许多遗传参数不仅能度量群体之间和群体内的遗传变异大小，而且能摧断群体中已发生过的进化事件，预期未来进化因素的影响。这对珍稀濒危物种保护措施的制定和实施有重要价值。在许多场合 ,利用形态性状来估测遗传变 异是最现实的方法 ,尤其是当需要在短期内对变异性有所了解或在其他生化方法无法开展之时 ,形态学手段不失为一种 有价值的选择（ ， 1991） 。其缺点是可供分析的基因位点太少，不能客观全面地反映遗传变异信息。由自然突变或物化诱变所获得的具有特定形态特征的材料所需时间长 ,且可能产生不利的性状，遗传表达有时不太稳定 ,易受环境条件、发育阶段及基因显隐性的影响。 (2） 染色体水平 染色体是遗传物质的载体 ,是基因的携带者。染色体变异（畸变）是生物遗传变异的重要来源。染色体变异主要体现为染色体组型特征的变异 ,包括染色 体数目变异（整倍性或非整倍性）以及染色体结构变异。植物中染色体的多倍现象是广泛存在的。目前已进行过染色体研究的被子植物中 ,绝大部分种类呈现种内多倍性 （洪德元， 1990） 。据 双子叶植物的统计 ,种内多倍性涉及114 科 660 属 2800 种，约 7%的 双子叶植物有种内多倍现象 （ 1989） 。此外，染色体数目的不规则变化会形成非整倍体，虽然常常导致败育或发育不正常，在进化中意义不大，但在不少动植物种内，非整倍性变异仍是很普遍的现象。至于染色体结构的变异在自然界中就更为常见。染色体水平上的多样性还体现 在染色体的形态（着丝点位置）、缢痕和随体等核型特征上，这些中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 特征的变异使种内出现细胞型的多样性。随着染色体研究技术的发展，如分带技术、细胞原位杂交技术的应用，在染色体水平上将揭示出更丰富的多样性。 (3）等位酶水平 20 世纪 50 年代出现的蛋白质电泳技术以及以其为基础的同工酶、等位酶分析方法使遗传多样性研究有了新的发展。 报道了乳酸脱氢酶在不同组织不同个体以及不同种里的不同形式的存在，这就导致了 “同工酶（ ”概念的产生：有机体常常产生酶的多种形式，即催化同一反应 的不同分子形式。 1969 年提出把同一基因位点的不同等位基因所编码的不同形式的酶叫做 “等位酶（ ”，把它从广义的 “同工酶 ”概念中分了出来。迄今为止，应用等位酶分析技术研究遗传变异已积累了丰富的资料，在采样原则、实验方法、数据处理和结果分析方面形成了一套统一的标准，并建立起检测居群遗传分化、遗传多样性和基因流水平的定量指标，使不同物种的研究结果可以在共同的基础上进行比较。我国学者利用同工酶分析技术对一些稀有的野生动物和主要家养动物进行了研究 （ ， 1991） 。然而，这一 技术仍然存在一些弱点，如只能检测编码酶蛋白的基因位点，对非结构基因则无能为力；所检测的位点数目受技术限制不可能很多（一般常用 20 30 个）；尽管目前可分析的遗传座位超过 100个，但对整个基因组来讲只是很小的部分。因此，一批等位酶位点的变异并不一定代表整个基因组的变异，而且有些隐蔽的变异可能无法通过电泳检测到 （黄瑞复等， 1991） 。 (4） 平 遗传物质的载体，遗传信息就是 碱基排列顺序，因此直接对 基序列的分析和比较是揭示遗传多样性最理想的方法。目前 原理上可大致分为两类：一类是直接测序，主要是分析一些特定基因或 段的核苷酸序列，度量这些片段 变异性；另一类是检测基因组的一批识别位点，从而估测基因组的变异性。直接测序是一件费时、费力、经济投入很大的工作，主要是针对一些比较保守的 段。对不特定基因组或 段识别位点的研究则十分普遍，目前常用的有 术、基于各种检测方法和重复序列分析技术。 术是用已知的限制性内切酶 消化从生物体中提取的 过电泳、印迹、探针杂交，最后用放射性自显影，显色或发光分析显示与探针互补的 段。 一种很有效的遗传标记，但 析程序复杂，技术要求高，成本昂贵，且存在放射性安全问题，使它的应用受到一定限制。 1985 年， 明了聚合酶链式反应（ 术 （ ， 1986） ，该技术的产生给整个分子生物学领域带来了一次重大革命，出现了一系列以 基础的分子标记技术，包括。还有最新发展的分子标记，如 。 原理很简单（ ， 1990），是用 10个核苷酸的随机序列寡核苷酸为单引物，对所研究物种的基因组 行扩增，产生长度为200 2000 段，经电泳分离即可检测 多态性。 用引物没有特异性，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 合成一套引物可以用于不同种生物的遗传分析，试验操作简便易行 ，不需克隆制备、同位素标记、迹等步骤，具有快速、灵敏、易检测、所需 品量少等优点。 但 有缺点，可重复性差，不同实验室的流程不同数据不可比较，难以交流。 指扩增的限制性片段长度多态性，其原理非常简单，引物设计十分巧妙，把双链人工接头接到基因组 双酶切片段两端，然后以此为模板，用标记的特异双引物（引物包括与接头互补的序列，内切酶识别序列和 3端 1 3 个选择碱基）进行 增，产物经变 性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离观察多态性。在这种方法中，基因组 限制性内切酶切割后，形成了大小不等的限制性片段，通过接头序列与引物的识别，以及引物 3端选择碱基的选择作用，将特异的限制性片段扩增并分离出来。 构建遗传图谱、标定基因、辅助育种、遗传多样性研究等方面具有广泛的应用前景，特别是在遗传多样性研究方面取得了一定的成果。 应所需 少，得到的条带丰富，灵敏性高，快速高效。与 比，具有多态性丰富，共显性表达，重复性好，条带稳定，不受环境影响，无复等位效应等优点。但对样品 量要求严格。 微卫星 短的、串联的简单重复序列（ 广泛存在于人类及动植物基因组中，主要是 1 4 个核苷酸，例如（ n 、（ n 、（ n 等。重复单位数目的差异形成了 点上的多态性。在真核细胞的基因组中，中每 10至少有一个微卫星 个微卫星两端多为相对保守的单拷贝序列，可以据此设计特异引物，经扩增微卫星 断来检测其多态性。由于微卫星 多态性十分丰富，目前已被用于大麦、大豆、水稻、小麦的遗传多样 性研究。一系列的研究结果表明 点的等位基因数且比其它任何标记所揭示的等位基因都多， 位基因数目与重复单位数目有明显的正相关， 列位点标记比 记更能有效地揭示遗传多样性，特别适用于其它类型标记所揭示变异水平低的物种。 较理想的标记，尽管设计和合成引物花费较大， 但是由于它具有位点丰富、分布均匀、多态性强、测定分析迅速、易于使用、引物序列公开发表等特点。使得 别适用于大量样本的研究，为群体遗传多样性及进化研究，种质评估，分子标记辅助育种提供了强有力的工具。 传多样性的度量参数 位点度量 1 多态位点比例（ P）（ of %100)n/k(P k 表示多态位点数； n 表示检测到的位点总数（多态位点指具有 2 个以上等位变异且平均每个等位变异频率大于 1的位点）。 2平均等位变异数（ A）（ of 示第 i 个位点的等位变异数； n 为检测的位点总数。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 3 有效 等位变异数（ of ， 1997）： 示第 i 个位点上第 j 个等位变异的频率； n 表示检测位点总数， m 表示第 i 个位点等位变异总数。 （ 1970）认为 A 更有用，因为它与等位变异的频率联系起来，更能反映群体的真实情况。 4平均期望杂合度（ 1978）： 示第 i 个位点上第 j 个等位变异的频率； n 表示检测位点总数， m 表示第 i 个位点等位变异总数。 量的是群体中等位变异的多少及其分布的均匀程度， 1973）将其定义为“基因多样度（ 是目前群体遗传结构研究最常用的指标之一。 5实际观察杂合度（ 1978）： 示第 i 个位点上的实际杂合度， n 表示检测位 点总数， 示第 i 个位点上第 j 个等位基因纯合基因型的频率， 示第 i 个位点上的测定到的纯合基因型的种类数。 6 样性指数（ I）（ n 1i 示第 i 个等位变异存在的频率， n 表示等位变异总数。 I 多用于表型多样性分析，被称为表型多样性指数。 7固定指数（ F）（ 1978）： 示实际观察杂合度 ； 示期望杂合度。 由于 衡是以足够大的随机交配群体为基础的，而有的物种如野生稻的天然居群则不可能达到这种理想状态，且可能由于自然选择、遗传漂变和近交等因素导致杂合体比例下降，造成 符。 F 就体现了这种不符程度的大小： F 0，则表示群体中杂合体不足； F 0，表示杂合体过量。 8遗传分化系数（ of tD s tG s t 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 别表示群体总的遗传多样度和群体内 的遗传多样度，计算同前述 计算 第 i 个等位变异在总群体中的频率，而计算 ，需先计算每个群体的 ， 第i 个等位变异在该群体中的频率，再计算所有群体 平均值得 示将总群体的遗传多样度分解为群体内的遗传多样度和群体间遗传多样度两部分，从而求出群体内遗传多样度占总遗传多样度的比例，用以衡量群体的遗传分化程度。 9 1987）： )p1( 其中 p 表示某一等位变异在所有群体中的平均频率， 表示群体之间的方差。 来检验群体分化的等级结构，主要包括三个方面的指标： 总群体中的平均固定指数，用来检验总群体中基因型频率与 衡的偏离程度； 群体的固定指数，用来检验群体中基因型频率与 衡的偏离程度； 群体间基因频率方差，用来衡量群体分化程度。 数值上是相等的，但在进行 仅能提供群体分化程度的大小，而且可以衡量群体基因型在不同水平偏离理论期望比例的 程度及其可能的原因。 10基因流（ of 1987； 1989）： 当 1 时，基因流就可以防止由遗传漂变引起的群体间的遗传分化（ 1931）。 11群体间遗传距离（ D）（ 遗传一致度（ I）（ ix jy n 1j 示群体 x 第 i 个等位变异， 示群体 y 第 j 个等位变异； m 表示群体 x 的等位变异数，