【毕业学位论文】（Word原稿）小尾寒羊GDF9基因和BMP15基因多态性及其与高繁殖力关系的研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 小尾寒羊 因和 因多态性 及其与 高繁殖力关系的研究 I 要 本研究 以控制 羊 高繁殖力的 骨形态发生蛋白15（ 5, 因及 控制 繁殖力的 生长分化因子 9（ , 因为候选基因，根据绵羊 对引物覆盖全部的外显子， 采用 和外显子 2 在 小尾寒羊和多赛特羊中 的 多态性，同时研究这两个基因对小尾寒羊 高繁殖力 的影响 。 对于 结果表明 ：只有外显子 2的第 1对和第 2对 引物扩增片段 在两个绵羊品种中均具有多态性，其余 4 对引物均不具有多态性 。对于引物 2 126只小尾寒羊母羊和 30 只多赛 特母羊中都检测到 3 种基因型 (统计结果表明： 小尾寒羊、 多赛特羊 因型频率分别为 因型频率分别为 序结果表明： 和 第 477位 碱基处发生 1 个 突变 (G A)， 小尾寒羊和多赛特绵羊都 产生了与 羊 相同的 477G A 突变， 该突变没有导致氨基酸的改变；小尾寒羊产羔数的最小二乘均值关系为 B 3种基因型间差异不显著 P 对于引物 2 126只小尾寒羊母羊和 30只多 赛 特母羊中都检测到 2种基因型 (D)；统计结果表明： 小尾寒羊、 多赛特羊 因型频率分别为 测序结果表明： 第 729位 碱基处发生1 个 突变 (G T)， 该突变导致 243 位氨基酸由谷氨酰胺改变为组氨酸； 因型小尾寒羊平均产羔 数比 因型多 ，差异极显著（ 研究结果表明 尾寒羊 的高繁殖力没有显著影响。 关键词 ： 绵羊，高繁殖力， 生长分化因子 9基因， 骨形态发生蛋白 15基因， 5（ (as an to of of to of in an of -1 to . of -3 to . as by -1 -2 AB B) in an of A of B of B GA) 77 bp of in B in to A. 477A in an as of AB an t P CC D) in an of C of D GT) 29 bp of in D in to C, in an of an D A an TT no on an 5 V 目 录 摘 要 . I . 文缩略表 . 一章 文献综述 . 1 效基因及其在家畜育种中的意义 . 1 效基因的概念 . 1 效基因的测定方法 . 1 效基因的应用前景 . 2 羊高繁殖力机制研究进展 . 2 胎绵羊品种 . 2 羊多胎的生殖生理 . 3 羊多胎遗传机制探索 . 4 外绵羊品种繁殖性状候选基因的研究进展 . 5 尾寒羊的研究概况 . 7 展绵羊高繁殖力机制研究的意义与前景 . 9 因的研究进展 . 9 因定位 . 10 羊 因图谱 . 10 因与生殖机理 . 11 因的研究进展 . 13 因定位 . 13 因图谱 . 14 因与生殖机理 . 14 间的卵巢功能的协同效应 . 16 羊 因和 因突变分析 . 17 禽繁殖性状选择的方法 . 19 究的目的及意义 . 20 第二章 因和 因多态性检测及序列分析 . 21 料与方法 . 21 验样本 . 21 株和载体 . 21 品和酶 . 21 要仪器设备 . 21 析工具软件 . 22 液试剂配制 . 22 要实验步骤 . 24 血液 提取 . 24 度和纯度的检测 . 25 因和 因 程 . 25 物设计与 增 . 25 析 . 28 物直接测序 . 28 果的电泳 . 28 因序列克隆和测序 . 30 物的纯化 . 30 受态细胞的制备 . 31 接反应 . 31 化 . 32 粒 小量提取 . 32 组质粒的鉴定 . 33 据统计分析 . 33 第三章 结果与分析 . 34 因组提取结果 . 34 因 结果与分析 . 34 因 增结果 . 34 态性检测结果 . 35 因引物扩增产物的克隆测序与序列分析 . 37 论 . 40 因 结果与分析 . 40 因 增结果 . 40 态性检测结果 . 41 因引物扩增产物的克隆测序与序列分析 . 43 论 . 45 第四章 全文结论 . 47 附录 1 绵羊 因外显子全序列 . 48 附录 2 绵羊 因外显子全序列 . 49 附录 3 测序图 . 50 参考文献 . 56 致 谢 . 63 作 者 简 历 . 64 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 g mg 克 ul 升 l ml 升 钟 bp 基对 kb 碱基对 nt 苷酸 磷酸脱氧核糖核苷 EB 化乙啶 二胺四乙酸 合酶链式反应 分钟转速 三羧甲基氨基甲烷 光密 度值 43链构象多态性 形态发生蛋白 长分化因子 丙 烯酰胺凝胶电泳 二烷基硫酸钠 ,N,N,N甲基乙二胺 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 效基因及其在家畜育种中的意义 家畜的主要经济性状大多属于可以度量的数量性状。有关数量性状的遗传机制，自出多基因假说以来，数量遗传学和家畜育种的理论和方法都是建立在微效多基因的假说之上，既数量性状是由许多微效基因的共同作用加上环境因素所决定的。由于这些基 因的效应都很小，以致不能对个别基因的效应进行观察和测定，只能用一些遗传参数（如重复力、遗传力、遗传相关等）来描述数量性状的遗传性质。数量性状的多基因一直是作为一个遗传整体用统计学方法加以研究和分析的。这个理论从整体上讲，对家畜的遗传改良发挥了巨大作用，但由于无法区分每个基因的影响，因而也就无法确定单个基因及其在染色体上的位置。 近 20年来，随着分子生物学和统计学的发展，人们发现动物某些数量性状表型值的变异，除了受微效多基因的控制外，还受某一单个主效基因（ 影响，也就是说，对于这些性状， 其遗传变异有很大一部分是由于单个基因造成的。这一现象引起了动物遗传育种学界的极大关注，对于这些性状，用传统的数量遗传学理论和方法虽然也能获得一定的遗传进展，但如果我们能对这些主效基因进行鉴别并加以合理的利用，则将大大加速遗传进展。 效基因的概念 主效基因是相对于微效基因而言的，它是指能对数量性状产生巨大效应的单个基因或位点，用特定的遗传学和统计学方法，可以对主效基因位点的基因型及其频率、该基因效应的大小进行测定和估计。究竟能产生多大效应的基因位点才可称为主效基因，目前尚无统一标准。有的学者（ 1974）提出当一个基因位点的效应在一个标准差以上时，可当作是主效基因，但事实上目前发现的主效基因的效应已远远超过了这个标准。 绵羊中最典型的主效基因是在 1982），该基因座纯合子的母羊比不带该基因的母羊平均多产羔 ，杂合子母羊也要多产 ，该基因以后又在冰岛羊、爪哇羊、剑桥羊等绵羊品种中发现（ 1998）。对羊瘦肉率和饲料利用率起主效作用的 1994， 1998； 1998； 998）与背最长肌和臀部肌肉生长有密切关系，该基因可使羊的产肉量提高 30%。此外，还在绵羊中发现了毛被的光泽基因，在山羊中发现了影响乳流速度的基因，在绵羊中发现宿主对线虫寄生的抗性主效基因（ ， 1998）。 另外，牛双犊基因的 的 体基因，与鸡生长、产蛋和腹脂沉积有关的分子标记等都有可能背确定为主效基因，随着这方面研究不断深入，还将有更多的新主效基因被发现。 效基因的测定方法 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 主效基因的确定涉及到 定位、主效基因的效应 分析等问题，人们已从不同角度研究分析了这些问题，提出了不同的方法。主要分为三类方法。 第一类方法是统计分析法（ 第二类方法是遗传连锁分析法（ 张勤， 1993）。这类方法是利用标记基因（ 数量性状位点（ 连锁来确定各个 效应的大小。利用这种方法已确定了影响瑞士褐牛产奶量的 羊多羔基因 羊瘦肉率褐饲料利用率起作用的 启顺， 1999）。 第三类 方法是候选基因鉴定法（ 在本实验中主要通过候选基因法来鉴定影响小尾寒羊高繁殖力的主效基因。候选基因鉴定法是定位数量性状基因的一种重要方法，其基本思路是根据已有的理化知识推断哪些基因可能参与了目标性状的形成，再分析这些基因在目标性状表型差异较大的品种或个体间的变化，最后在分子生物学水平证实基因的变异对目标性状表型变异的决定作用。国内外已成功地利用此法定位了一些主效基因，如控制 兰尼定受体基因以及产仔数基因 效基因的应用前景 主效基因的检出和分离为遗传育种科学带来了新的飞跃和机遇。在理论，它是对传统的多基因假说的重要发展和更新，表明在数量性状遗传机制中不仅有大量微效多基因，还有少数有重大影响的主效基因，不仅存在着基因的加性效应，还存在着基因间的非加性效应，主效基因的存在及其在群体中的频率对传统数量遗传理论为基础的遗传参数产生显著影响，并将影响以遗传参数为基础的一系列选择理论。在实践上，将为动物遗传育种带来一些新的手段：第一，主效基因分离时，通过有利基因型的固定，以及标记辅助选择（ ，可获得大大超过常规选择的进展；第二，主效基因的分离和固定可打破某些性状的遗传拮抗，使育种目标尽快得以实现；第三，主效基因的分离使转基因技术应用与数量性状成为可能，从而产生巨大的经济效益；第四，当有利的主效基因在某一品种中被检测出来时，可以通过标记辅助渗入（ 方法，将主效基因引入到另一群体。 由于主效基因都是影响经济性状产生巨大效应的基因，主效基因的应用将为生产带来巨大效益。例如绵羊的产羔率若要提高 40%，约需 20代才能完成，而引入多产羔主效基因 一目标可在一二代内实现，国际上已掀起国际基因知识产权争夺战，这也是当前值得重视的一个新动向。 羊高繁殖力机制研究进展 胎绵羊品种 据不完全统计，世界上产羔率为 200%及以上的羊种已有 10 余种。如边区来斯特（英），产羔率 200% 210%，凡士里代（英，）产羔率 200%，有 角 陶塞特（英），产羔率 160% 220%，克伦森林（英），产羔率 175% 200%，连凡诺林（英），产羔率 200% 230%，骑士沃台勒（英），产羔率250% 300%，东佛里生（德），产羔率 205%，兰德瑞 斯（芬），产羔率 270%，阿福浪申（法），产羔数 187% 203%，毛兰姆（美），产羔率 200%，布鲁拉美利奴（澳），产羔率 220%，小尾寒羊（中），中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 产羔率 240% 270%。其中，布鲁拉（ 利奴羊尤为世人注目，该品种中优秀种群的平均产羔率可达 350%,在新西兰，纯合子母羊的平均断奶羔羊数为 。我国育成的多胎绵羊有湖羊和小尾寒羊，两者以非季节性发情和多胎著称，是我国绵羊群体中极有价值的基因库。 羊多胎的生殖生理 一般认为，排卵数越多，则产羔数越多。 胎产羔数与排卵数间是曲线关系，有人专门对每胎产羔数进行选择，结果是每胎产羔数的增加总伴随着排卵数的提高，排卵数的提高等于或大于每胎产羔数的增加。卵巢内存在许多原始卵泡，但并不是原始卵泡越多，排卵数就越高，不过颗粒细胞层在 3级卵泡）与排卵数呈正相关。 1981）在比较罗曼罗夫羊与法国岛羊的排卵数和卵泡数时，观察到排卵数高的罗曼罗夫羊存在较多的次级卵泡。 1978)报道，在排卵数高的绵羊，卵泡在性周期的发育较早，对促性腺激素感受性也高，并且闭琐卵泡 亦少。可以说内分泌作用使排卵数高与排卵数低的绵羊表现为不同的卵泡发育类型。 1971） ,1987） 报道，即使在自然条件下，对排卵数多的绵羊使用孕马血清促性腺激素，其超排数也高。 分泌 黄体激素（ 据认为，排卵数高与促进性激素的浓度有关。芬兰的兰德瑞斯羊和罗曼若夫羊以及布鲁拉美利奴羊血液中促黄体激素浓度高于排卵数低的绵羊，而 种浓度的差异在出生后的一个月即表现出差异来。 1979）报道，从发情开始到 值出现的时间与 排卵数有相关关系，但与 卵泡素（ 泌上的差异决定早期生长卵泡的数目及其最终闭锁的卵泡比例，罗曼若夫羊和布鲁拉美利奴羊的腔前卵泡和有腔卵泡都比非多胎品种多，这与黄体退化和排卵前促性腺激素峰值之间出现的 平较高有关，虽卵泡期 度降低，但多胎母羊 较高，这有利于提供大量有腔卵泡，这些卵泡含有能使 度增加的适量受体，并能使促卵泡最后成熟及排卵。因而一般认为多胎绵羊血液中促卵泡激素的浓度也高，而且其重复力也比 ，但是 1985）等在比较芬兰羊与萨福克羊时，没能测出 二醇 假设促性腺激素（ 浓度相同，那么排卵数高的原因大概是丘脑下部和垂体对类固醇激素（雌二醇 雌酮、雄缁烷二酮等）或某种抑制因子所产生的负反馈作用的感受性降低而导致促性腺激素的释放。经实验发现，多胎性与非多胎性绵羊血液雌激素含量无明显差异。不过，一般认为影响排卵数高低的因素有品种、季节、营养状况以及 间接作用，还有丘脑中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 下部和垂体对雌激素的负反馈作用的感受性降低等。 脑下部和垂体对雌激素负反馈作用的感受性也有季节变化，丘脑下部的瞬间变化与排卵数有关。 胎存活 胚胎死亡率一般为 20% 认为，排卵数高的品种因胚胎死亡而引起的产羔数的减少要比排卵数低的品种大得多。 1986）认为，母羊的胚胎死亡有可能一部分是排卵时间与排卵后孕酮开始分泌的时间不同步所致，也就是说排卵数增加时胚胎死亡率也增加。因而排卵数越高，各卵泡排卵的时间也越长，因而早期妊娠阶段孕酮开始分泌的时间与各个胚胎发育阶段不同步的机会就越多。 （ 1989） 认为，胚胎的成活与排卵前后的孕酮的基础水平有关。 宫保持胚胎或胎儿的能力 母羊排卵多的时候，每个卵子在子宫内都育成的话，那么能否维持妊娠将与母羊子宫保持胚胎的能力有关。 975)将 2个或 3个胚胎移植给芬兰兰德瑞斯羊和盖洛威羊（非多胎羊），并比较了其分娩的羔羊数。在移植了 3 个胚胎时，兰德瑞斯羊平均产羔数为 ，盖洛威羊仅 植 2个胚胎时，分别为 品种间子宫保持多胎的能力无很大差异。然 而，给 23 只布鲁拉美利奴羊分别移植 3 个胚胎后，其中有 15 只各产下 3 羔，这主要是因为布鲁拉美利奴羊子宫保持胚胎或胎儿的能力高的缘故。 羊多胎遗传机制探索 羊多胎主效基因的发现 1919年，澳大利亚新南威尔士洲 其中毛型美利奴羊群中鉴定出 1只多胎母羊，并将该母羊和其后代组成了一个分离群，后经不断发展和选育羊群， 1944年此羊群定名为布鲁拉（ 1965 年在购买布鲁拉母羊基础上，澳大利亚联邦科学与工业研究组（ 过扩 群和选择，到 1978年，母羊多胎产羔数由原来的 1973年，澳工组织赠给新西兰 3只多胎公羊。从此，新西兰开始建立高繁殖母羊群。 1980年，澳大利亚和新西兰两国研究结果表明，布鲁拉美利奴羊繁殖力特性极有可能是单基因遗传，后来，进一步的研究证实，布鲁拉美利奴羊的多胎性是受一个主效基因 自澳大利亚在布鲁拉美利奴羊群中发现 后在英国剑桥羊、冰岛绵羊、爪哇绵羊等世界不同地区的绵羊中发现了类似 此， 以看作是携带 不是一个绵羊的品种。 羊多胎主效基因的作用及其机理 诸多研究表明，多胎绵羊产羔率高的主要基因是其排卵数高，澳大利亚和新西兰两国通过绵羊杂交、后裔测定及用腹腔镜观察母羊排卵数等手段，对布鲁拉美利奴羊高繁殖力特性的遗传模中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 式研究发现， 因是一显性基因，基因型为 +的普通羊相比，平均排卵数增加 产羔数增加 因型为 F+的杂合型羊，平均排卵数增加 羔数增加 。携带繁殖主效基因的爪哇绵羊比不携带者排卵数增加 。给多胎品种和单胎品种分 别移植 2枚或 3枚卵子，其受品种间影响 的产羔数差别很小，说明品种多胎主要取决于排卵数。 带有多羔突变基因的绵羊具有产羔率高、多胎性遗传分离、突变基因可以固定并能通过杂交转移给其它品种等特点。 (1982 年 )的研究结果已证实，布鲁拉美利奴羊的多胎性受位于常染色体上的影响排卵数的显性基因 变基因携带者除排卵数和产羔数外，在其它性状方面与普通羊没有明显的差异。我国学者杜立新等对多胎滩羊群的研究亦证明了这第一点。据 992)测定，携带 垂体和卵巢功能方面与非携带者之间有明显的差异，其血浆中具有较高的 平，且对与编码变的座位不在上述两个基因座位中或其附近，已知影响卵泡发育的基因亦被排除在 外绵羊品种繁殖性状候选基因的研究进展 目前，国外研究发现影响绵羊繁殖性状的候选基因主要有如下几个：象 、 简述如下： 羊的 因 1919 年澳大利亚 族在新南威尔士州以中毛型美利奴羊为基础，扩繁成为今天的被绵羊和山羊命名委员会命名为 B= 对绵羊的排卵数是加性效应，对产羔数则是部分显性的。通过对人类染色体 4现了 B， 并且 号染色体上 在的研究大部分集中在与卵泡发育有关的生殖激素变化上，最近在分子水平上发现， 黄体生成素（ 感。 2001）分别发现， 变引起，突变体 ）不敏感，从而高剂量的 泌，使排卵数上升。 羊的 因 （ 基因也称 在新西兰多胎的 系中发现的。这个家系是在一个多产的 羊（ 基础上建立的。在 羊雌性后代群体中发现了高排卵数的突变，对其后代公羊进行分离研究，推断控制排卵数的基因位于 之为 因（ 因携有一个基因拷贝的公羊（ Y）与杂合型（ +）女儿交配，结果表明纯合型（ ）母羊有线纹性卵巢而且无生殖能力。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 在 羊另一个家系中发现了一个含有 性（ 基因，与 羊无关。但携带同样的 代（ ）无生殖能力母羊的线性卵巢与 母羊的线性卵巢难以区分，表明这两家系携带的突变在同一个基因上。 羊的 原产于新西兰，是 20 世纪 50 年代用边区莱斯特和罗姆尼羊杂交育成的， 1968年成立品种协会，通过多年选育 1984 年，在 一只自 1982 年开始使用的基础公羊（ 79女儿群中发现了高排卵数记录，随后获得的该公羊的高排卵数育种值验证了这一点，因此该公羊的后代被命名为 2000年，在 基因是位于绵羊 遗传模式与 因座（ 同，所以根据国际绵羊和山羊遗传命名委员会的命名规则将其命名为“ 座位是“ 等位基因的符号是 因 剑桥羊 (种主要是由 个品种培育而成的，但还包含其它一系列（多达 10 个）遗传背景不同的多胎绵羊品种的血统。 2004年， 2004)以 现存在 3 个功能突变 变、 变）和 与 将 别命名为 X 代表 X 染色体， G 代表 B 代表 G 代表 同时将突变所对应的野生型定义为 和 。同时 发现 羊高繁殖力基因 970 种和多胎品系（据窝产羔数选育的高繁殖力绵羊）先进行互交，而后再与 在爱尔兰以终生窝产羔数为选择标准形成的一个 种）进行杂交 培育出来的一个品种。该羊具有高繁特性。 2004 年， 报道 5号染色体上 X 染色体上 个基因的突变（即 变和 变）与 联。 羊的 因 种，据尾部特征不同可分为爪哇细尾羊（ 爪哇肥尾羊（ 该羊的共同特征为非季节性发情，平均窝产羔数约 。 1991 年， 证明了在 羊中存在主效基因，且该基因已被命名为 2002 年， 249 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 因 现代冰岛绵羊（ 能是当 今世上最古老最纯的绵羊驯养品种，它是九、十世纪由早期北欧海盗殖民者带入冰岛的绵羊的直系后代，并只进行本品种内选择育种。该羊属北欧短尾型羊，季节性繁殖品种。母羊 11 月初发情，可持续到 4月份。冰岛绵羊中存在一个高繁殖力主效基因的假设在 1996年已得到证实，且该基因已被命名为“ 其发现过程与布鲁拉基因相似。 2001年 法，对 一个 羊 基础群收集了 13年的数据（计 903个窝产羔数记录）进行了分离分析，结果证明 因存在于该群体中。 用绵羊高繁殖力基因 羊是法国绵羊中最重要的品种，全国约有 120 万只。该品种具有多个品系，但多只是作为产奶和哺育羔羊之用，但自八九十年代始选择的主题开始转变为肉用性状。为提高用绵羊的繁殖性能，法国在以人工授精机制作为后裔测定辅助条件的基础上，自 1975年就已开始对该品种进行 选择。 003年发表论文证明了在 尽管在上述绵羊品种中发现了对多胎性状具有一定作用的主效基因，但对于这些基因的精细定位和作用机制尚需深入研究。 尾寒羊的研究概况 小尾寒羊是冀、鲁、豫、苏、皖交界地区的一个优良绵羊品种，是当地劳动人民长期选育的地方良种。小尾寒羊素以早熟多胎、四季发情、全年可配种产羔、体格高大、早期生长发育快、肉质好、适应性好而著称于世，被专家们誉为“世界超级羊”，是我国的国宝。小尾 寒羊作为全球重要的遗传资源，受到了国内外的瞩目。近十几年来，全国各地都到山东小尾寒羊产区购买小尾寒羊，形成了“小尾寒羊热”。山东小尾寒羊不仅在数量上得到大幅度增长，而且在繁殖性能、肥育性能、肉品品质、毛皮性能、饲养技术、染色体组型、生理指标、血液成分、适应性等方面积累了大量研究资料。 种数量 山东小尾寒羊的数量曾受到绵羊杂交改良工作的冲击 (王景元， 1985)，最低年份仅存养 3万多只。山东省菏泽地区于 1964 年开始有计划地选育小尾寒羊，经 20 多年的选育提高，小尾寒羊的数量有了大幅度增长。王建 民等 (1997)报道， 1995 年山东小尾寒羊存栏量达到 只，可繁殖母羊占 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 8 貌特征 小尾寒羊为肉毛兼用型品种，属蒙古羊系。被毛多具白色，公羊有三棱形螺旋状大角母羊有小姜角或无角；头狭长，鼻梁隆起，耳大且下垂。体躯平直，四肢高，蹄质坚实呈蜡黄色。脂尾短而肥，尾尖紧贴