【毕业学位论文】（Word原稿）家蚕浓核病毒(镇江株)部分核苷酸序列分析及主要结构蛋白基因(vp)的表达特种经济动物饲养硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 家蚕浓核病毒 (镇江株 )部分核苷酸序列分析及主要结构蛋白基因 (表达 to 蚕浓核病毒 (镇江株 )部分核苷酸序列分析及 主要结构蛋白基因 (表达 中文摘要 本文对家蚕浓核病毒 (镇江株）的部分核苷酸序列进行了研究，克隆并用大肠杆菌表达了主要结构蛋白基因，试图从分子水平、基因水平对它与山梨株的亲缘关系进行探讨。 一根据已发表的日本山梨株的序列片段 1（ 计了一对引物，克隆了 主要结构蛋白基因（ 测序并用 件分析了两者的同源性。该片段与山梨株 有 29 处核苷酸发生了突变；推测的氨基酸序列与山梨株的同源性为 有 7 个氨基酸发生了替换。该序列已经在 录，登录号为 根据已发表的日本山梨株的序列片段 2（ 两个开放阅读框（ 间设计了一对引物，扩增得到了 992于两个开放阅读框（ 间的一个片段，测序并用 I - 软件分析了两者的同源性。该片段与 梨株相应部分的同源性为 位于两个开放阅读框（ 间的序列有缺失或插入突变。 三 . 在 据库中用 件在线检索，除家蚕浓核病毒山梨株 ，未发现其他同源序列。 四 . 将病毒的主要结构蛋白基因（ 入到表达质粒 克隆位点 与 之间，使其位于诱导型启动子 后 ,转化到 株，进行了诱导表达。表达产物在 小约为 53预计的大小大致相近。用测表达产物，可以与病毒的抗体产生特异的反应，表明其为病毒的结构蛋白基因。 五上述结果表明， 江株和山梨株一样，病毒的 基因组是由两个片段组成，并且两者的核苷酸序列有很高的同源性（高达 98%以上），而与其他浓核病毒的核苷酸序列没有同源性，可以认为两者是同种病毒的不同分离株。 关键词 家蚕浓核病毒 (镇江株 ) 主要结构蛋白基因 克隆 表达 n to NA E. - 1. on a of b, is to be NA by of 29 of vp No Y 236978. 2. on NA of of b by 15 in 3. no NA 4. of of a 53KD to of 5. of NA in 8%) no of 本文缩写词及英汉对照 aa 基酸 苄青霉素 硫酸铵 43蚕浓核病毒 bp 基对 血清白蛋白 ,4硫苏糖醇 EB 化乙锭 二胺四乙酸 - V - 丙基硫代 端反向 重复 碱基对 道尔顿 克隆位点 蓝四唑 苷酸 B 培养基 放阅读框 酸缓冲盐溶液 合酶链式反应 蛋白酶 K 分钟转速 二烷基磺酸钠 ,N,N ， N ,N,N ,N 酸 噬菌体 l 升 前 言 家蚕浓核病毒 (感染家蚕的一种重要的病毒 ,特别是在夏秋季。 与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同，家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞，细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染，在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加，形成褶皱，最后感染细胞脱落到肠腔中。自从 20 世纪 70 年代末日本学者证 实家蚕软化病是由于浓核病毒感染引起的以来，已经分离得到了多个株系。根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异，分为 那株）和 山梨株为代表）。 其它细小病毒不同，病毒基因组包含 2 条大小分别为 单链 子，并且末端缺少形成回文结构的序列。但 2 条 子的末段有 53同的- 反向重复序列（ 推测每个病毒颗粒中可能只含有 2 条 子中的 一条。病毒结构蛋白由 6 种蛋白组成。 我国学者早在 20 世纪 50 年代末就已经发现，家蚕软化病是由病毒感染引起的。但由于种种原因对该病毒的特性没有进行进一步的研究，直到 20 世纪 80 年代初才证实该病毒是一种浓核病毒。后来进一步证实该病毒与家蚕浓核病毒山梨株在血清学特性、病毒基因组等方面有许多相似之处。但两者在病理学特征、家蚕对该病毒的抗性等方面又不尽相同，镇江株除了感染家蚕中肠上皮组织的柱状细胞外，在感染的末期还可以侵染杯型细胞； 家蚕对镇江株的抗性基因位于第15 连锁群，而对山梨株的抗性基因则位于 17 连锁群。 近年 来，日本学者对山梨株进行了比较深入的研究，而中国（镇江）株的研究则相对较少。本文对 江株的部分序列进行了研究，试图从分子水平、基因水平对它与日本山梨株的亲缘关系进行探讨；克隆并在大肠杆菌中表达了镇江株的主要结构蛋白基因，为进一步研究该病毒结构蛋白基因转录和转译的策略以及研究病毒结构蛋白在病毒组织细胞趋向性和致病性方面的作用提供依据。 目 录 中文摘要 . I . 文缩写词及英汉对照 言 . 第一章 :文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 1. 昆虫浓核病毒的分子生物学 1 2. 家蚕浓核病毒的研究现状 . 8 第二章 : 家蚕浓核病毒 (镇江株 )部分核苷酸序列的克隆和序 列测定 14 第一节 : 家蚕浓核病毒 (镇江株 )主要结构蛋白基因的克隆和序列测定 14 . 14 . 19 第二节 : 家蚕浓核病毒（镇江株） 分核苷酸序列的克隆和序列测定 24 . 24 . 25 第三节 : 讨 论 27 第 三章 : 家蚕浓核病毒 (镇江株 )主要结构蛋白基因（ 大肠杆菌中的表达 . 28 . 28 . 35 结论 . 37 参考文献 . 38 附录 1 44 附录 2. 47 致谢 49 作者简介 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 1 - 第一章 文献综述：昆虫浓核病毒的研究进展 浓核病毒 (感染无脊椎动物，能自我复制的细小病毒。它是一类无包膜的球形病毒（ T=1），直径为 18毒的衣壳由 60 个近球形的亚基组成。病毒颗粒包埋了一段线性的，大小为 4000核苷酸（ 单链 因组，是迄今为止发现的最小的动物 毒基因组可以是正链也可以是负链，而且被包埋在不同的颗粒中，在不同的浓核病毒中两种颗粒的比例不同。 浓核一词最早（ et 964）是用于描述感染了该病毒的大蜡螟 (虫细胞，过分膨胀、细胞核的浓染等细胞组织病理特征的。大蜡螟浓核病毒（ 成为细小病毒科病毒的第一个成员。后来又在人、鼠、家禽等脊椎动物 ，家蚕、埃及伊蚊、河蟹等节肢动物中发现了许多细小病毒科成员。 2000 年公布的 次报告：根据其宿主及繁殖方式的不同，把细小病毒科病毒分成 2 个亚科，分别是感染脊椎动物及其培养物的细小病毒（ 科，感染无脊椎动物及其培养物的浓核病毒 (科，每个亚科又分别设有 3 个属。浓核病毒的寄主域较广泛，目前已经在昆虫纲的鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目和蜻蜓目中发现了大约 25 种浓核病毒，另外在甲壳纲动物河蟹中也发现了一些类似浓核病毒的病毒。 细小病毒科病毒由于其特殊的复制方 式和独特的基因组结构，是研究真核基因复制、表达调控的良好材料，颇受分子生物学家的重视，浓核病毒在细小病毒中占有重要地位。浓核病毒可用作基因转移载体和表达载体 ,是昆虫转基因研究较好的载体；也是研究外源基因在昆虫体内表达的良好载体。另外在生物防治方面 ,发现浓核病毒在自然界广泛分布 ,并且往往与昆虫杆状病毒混合感染宿主 ,浓核病毒本身也有很强的致病力 ,野外的许多浓核病毒可以在几天内使 90%的宿主死亡 ,因此它在控制野外害虫方面的作用也受到生物防治专家的关注。正因为浓核病毒有这么多优点，近年来对该病毒研究，特别是在基因组 结构，其编码蛋白质功能和基因表达的调控等方面取得了一系列进展。本文就昆虫浓核病毒在这些方面的进展作一综述，并着重介绍家蚕浓核病毒的研究进展。 1. 昆虫浓核病毒 (分子生物学 因组结构和分类 因组结构 家蚕浓核病毒伊那株 (基因组序列是第一个被测定的浓核病毒（ et 1987， 1990； 后来，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 2 - 2001 年 对家蚕浓核病毒的全序列进行了重新测序（ 测得序列全长 5076个末端有 230的反向末端重复序列 (可以折叠形成“ J”形的回文结构。左边大的 测编码非结构蛋白 间有一个小的 测其编码另一个非结构蛋白 边的编码框 测编码结构蛋白 测可能从开始的 4个 渗漏扫描机制（ 译出 4 种结构蛋白。 1991 年 对埃及伊蚊浓核病毒（ 99%的核苷酸序列进行了测定 (发现是一种与 那株 )不同的浓核病毒。末端序列与可以形成 ”T”形的回文结构，但与其他浓核病毒不同的是不存在反向末端重复序列 (在正义链上有 3 个开放阅读框 别是左边 边 中间 边的 从第一个 29始翻译可以得到一种由 849个氨基酸组成， 分子量为 97518道尔顿的蛋白。与细小病毒编码蛋白的氨基酸序列比较发现，有 200 个氨基酸与细小病毒非结构蛋白有非常高的同源性，在这段氨基酸序列中有嘌呤三磷酸结合蛋白，因此推测可能是非结构蛋白 间的 全在左边的 部，第一个 377果从这里开始翻译可以得到一种由 382 个氨基酸组成，分子量为 40996 道尔顿的蛋白，推测可能编码另一个非结构蛋白 边的 一个 于 2561果从这里开始翻译可以得到一种由 358 个氨基酸组成，分子量为 40505 道尔顿的蛋白 ，推测可能编码结构蛋白。第二种结构蛋白可能是由第一种结构蛋白通过酶切产生的，分子量大约为 38000 道尔顿的蛋白。另外在负意链上有一个小的 843以编码一种由 237 个氨基酸组成，分子量为 26360 道尔顿的蛋白，其功能未知。 1992 年等 定了鹿眼蛱蝶浓核病毒 (全序列(发现与家蚕和埃及伊蚊浓核病毒的基因组结构不同。全长为5908列的两个末端有一个长 为 517反向末端重复序列（ 其中基因组两个末端的96以形成“ Y”形的发夹结构， 1 64对形成柄（ 34 43对 50 58对形成“ Y”的两个对称臂 (通过计算机分析预测末端的 517以形成一个包括 12 个茎（ 8 个环（ 复杂结构。鹿眼蛱蝶浓核病毒的主要编码区域分布在两条链上，与家蚕浓核病毒（ 埃及伊蚊浓核病毒（ 同。最大的 一条链上，其余的 它的互补链上。 度为 2430555 2985 在 534近有保守的启动子序列，第一个 555围有 6 个核苷酸与 则一致。如果从该位点开始转译可以得到一种由 810 个氨基酸组成的分子量大约为89蛋白，在它的下游还发现了 5 个 结构和启始密码子，预测可以编码蛋白的分子量分别为 59543931 24这一序列中还发现了一些保守的剪接的受体（ 3 个）和供体（ 8 个）位点。推断的 码 的氨基酸序列与其它细小病毒的氨基酸序列比较，发现有 39 个氨基酸（ 174细小病毒（ 构蛋白 一区域就是自主复制细小病毒结构蛋白中保守的 此推测它编码结构蛋白。 互补链上，最右边的 5637665 927 16424662成， 全在 （ 4652但是属于不同的阅读 框，预测它们分别是病毒的 3 个非结构基因 别编码一种由 545、 275 和 186 个氨基酸组成，分子量大约为 6030 20 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 3 - 的蛋白。它们由启动子 5476 录出共同的 后通过不同的翻译方式产生 3 种非结构蛋白。 到目前为止，除了上述 3 种，已经测定了十多种浓核病毒的基因组序列，如表 1 所列： 表 病毒种类 序列号 测定时间 序列发表作者 002 , 6/36 002 , , , et 994 , X, 003 V, 1999 1995 , , ; , , , et 001 997 , N, et 32896 1994 004 J, N, O 003 ., M, , et 001 L, , , et 000 , u Y 2000 年公布的 次报告，根据各种浓核病毒的基因组结构，末端结构等的差异，把中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 4 - 浓核病毒亚科的成员分成 3 个属：相同病毒属（ 简短病毒属（ 浓核病毒属（ (1) 相同病毒属（ 该属病毒以 那株）为代表种， 该属的暂定成员。基因组的大小大约为 5个末端有 230反向末端重复序列 (可以形成“ J”形的回文结构 (图 中间有 3 个 测左边 中间的 别编码非结构蛋白 边的编码 4 种结构蛋白（ 正义和负义几乎以相同的频率被包裹在病毒颗粒中，在合适的抽提条件下抽提基因组 以退火形成 图 那株）末端的回文结构 he (2) 简短病毒属 （ 该属病毒以埃及伊蚊浓核病毒（ 白斑伊蚊浓核病毒（ 代表种，另外河蟹浓核病毒 该属的暂定成员。基因组大约为 4端可以形成“ T”形的回文结构（图 但缺少 与其他浓核病毒不同。基因组的 3 个 一条链上，左边 中间的 别编码 边的 码 2 种结构蛋白（ 与其他 浓核病毒不同的是，该属病毒的衣壳蛋白对负义链有偏好性，大约有 85%的病毒颗粒包裹的是负义链，只有 15%的颗粒包裹的是正义链。在恰当的抽提条件下，可以产生 30%的 70%的 图 端的回文结构 3) 浓核病毒属（ 该属以鹿眼蛱蝶浓核病毒 (大蜡螟浓 核病毒（ 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 5 - 代表种，是目前暂定成员最多的一个属，包括 。基因组的大小大约为 6端的结构由大于 500序列组成 以折叠形成“ Y”形的回文结构（图 该属成员的编码框分布于两条链上的 5端，有 3 个 一条链上，编码 3 个非结构蛋白 一条链上的 编码4 个结构蛋白 ( 病毒衣壳蛋白可以以几乎相同 的频率分别包埋正义链和负义链。在恰当的抽提条件下， 以退火形成 图 端的回文结构 核病毒的基因组结构 (阴影部分表示 框表示 构域，空框表示 of in 另外家蚕浓核病毒型（山梨株）的基因组是由两条具有相同的 53端的 成，并且这两条 包埋在不同的病毒颗粒中，在恰当的抽提条件下，病毒的两条 以分别退火形成两种不同 1995 年 曾建议可以在浓核病毒亚科中由家蚕浓核病中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 6 - 毒型单独成立一个新属 多分体浓核病属（ 码的蛋白质的功能 浓核病毒亚科的病毒与细小病毒亚科的病毒一样只有两种基因，分别编码结构蛋白 (非结构蛋白 ( 结构蛋白是包裹病在毒基因组外面的蛋白，其最主要的功能是在病毒脱离宿主细胞后保护病毒遗传物质，使其在恶劣的环境条件下仍保持侵染性。另外，病毒的结构蛋白在病毒进入细胞质，从细胞质进入细胞核等过程中也发挥了极其重要的作用。例如， 2001 年 等发现家蚕浓核 病毒型最大结构蛋白 序及分泌型磷脂酶（如：蛇毒和蜂毒等）的基序有高的同源性。 （ 2001）把与 很高同源性的猪细小病毒（ 活性中心的关键的 2 个氨基酸（组氨基和谷氨基）突变，发现病毒虽然能进入宿主细胞但不能感染宿主，主要是由于突变病毒丧失了把基因组从包涵体释放到细胞核中的能力。 大的结构蛋白可能也具有类似的功能。 在浓核病毒非结构蛋白中发现有 基序，推测非结 构蛋白在病毒基因组的复制，病毒 转录中有重要的作用 ,可能还起细胞毒素作用。研究表明细小病毒的复制方式为滚环复制（ 在滚环复制启始蛋白家族中发现有 3 个保守的有单链切割活性的基序，其中的 2 个基序在细小病毒亚科的非结构蛋白中已经被证实。 等 (2002)研究了鹿眼蛱蝶浓核病毒（ 结构蛋白 生物特性，通过与细小病毒亚科成员 非结构蛋白 复制蛋白 8 比较发现，在 结构蛋白 个滚环复制的基序，位于 132 u)基序和位于 182有 且具有切刻酶活性的x)基序。在 )基序含有可以与 型的是 )(D/E)基序，在 4 个疏水氨基酸残基的后面有 2 个酸性的氨基酸残基，二价阳离子是协同因子。把 因构建成融合蛋白，通过电泳迁移率变化分析和 护试验发 现融合蛋白可以与 端序列特异地结合，结合位点是位于末端回文结构含（ 区。另外融合蛋白还有单链特异切刻活性，可以在 测的复制原点切开单链，主要是在92 位与 93 位之间的 T 和 95 位的 T（ 5 2 个位点切开，这种作用依赖于二价阳离子辅助因子但不需要 水解。 序有依赖于 活性。显示有滚环复制启始蛋白的特性，特别是细小病毒复制蛋白的特性。这表明 细小病毒亚科的 能具有相同的作用。 等（ 2004）研究了 结构蛋白 核病毒属特有的基因）的功能，发现该蛋白是病毒在 52 细胞系和秋粘虫（ 虫中复制所必需的基因。 另外， （ 1994）发现 以激活结构基因的表达。 浓核病毒非结构蛋白 作用还不是很清楚，但对脊椎动物细小病毒研究表明它在病毒的复制、翻译和病毒衣壳的组装过程中有作用（ et 990 1993;et 997）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 7 - 毒基因表达的调控 浓核病毒虽然基因组结构比较简单，只有结构和非结构两种基因，但每种基因有可以翻译产生几种不同的蛋白。哺乳动物细小病毒的启动子结构和转录调节已经进行了广泛的研究，这些病毒通过可变剪接产生多种有共同末端的转录本，从而增加了蛋白的种类。并且发现核心启动子对非结构蛋白 存在是敏感的。关于昆虫浓核病毒基因表达调控的研究报道还很少，推测与脊椎动物细小病毒一样，可能也是非常复杂的，可以在转录启始、剪接、转译和蛋白质水平进行调控，而且不同的浓核病毒的调控方式也不尽相同的。 埃及伊蚊浓核病毒可 以从 7 位点附近的 动子和 61 位点附近 动子转录出长度分别为 3500 1200右的转录本，在 92 位点它们有共同的加尾信号，这种现象在细小病毒（除了 员中是比较常见的。 1200右的转录本编码两种结构蛋白 3500转录本编码两种非结构蛋白 边 2262码 间 1158测编码 边 码 中 过蛋白酶剪切产生的，或者利用不同的起始密码子。由于 基因组中没有明显的 切序列，因此 是由 动子转录出来的 译而来的。 （ 1997）研究了 7 启动子的特性，发现在基础表达水平 一样有效地利用。另外启动子下游最开始的 100基因的表达是必需的，这一序列可能参与了翻译水平的调节。 （ 2001）研究了 构基因的启动子 引物延伸的方法确定转录的启始位点，发现转录启始于0 点，而不是 点，这与杆状病毒的早期基 因一致。缺失和突变试验发现， 缺失可以降低 93%的蛋白质表达的水平，而 时他们分析了 末端序列对结构基因表达的影响，当只有一个末端序列时 ，没有末端序列时可以提高 2 倍， 2 个末端序列均存在时则可以提高 37 倍。 （ 1999）在分析 的黑胸大蠊浓核病毒（ 基因组结构和预测的蛋白质序列时发现，除了位于末端的 动子外，在基因的内部还存在一个启动子（ 推测可能调节非 结构基因的表达。分析 构基因的 ，发现病毒结构基因可能是以可变剪接的方式产生的，基因组中存在多个剪接位点，并且在 有 A）加尾现象。 由于浓核病毒结构简单，对宿主有极强的依赖性。因此宿主细胞的细胞因子及宿主细胞所处的细胞周期对浓核病毒基因表达的调控有重要影响。已经发现细小病毒的复制只有当宿主细胞处于基因组 制期才能进行，病毒才能侵染宿主细胞。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 : 昆虫浓核病毒的研究进展 - 8 - 2. 家蚕浓核病毒 (研究现状 家蚕浓核病毒是继家蚕核型多角体病毒 (家蚕质型多角体病毒 (病毒性软化病病毒 (后发现的又一种感染家蚕的病毒。在此之前蚕业生产上软化病的流行，误认为都是由病毒性软化病病毒引起的。其实不少是由病毒性软化病病毒与家蚕浓核病毒并发或者由家蚕浓核病毒单独引起的。 1975 年日本的清水在长野县伊那郡的农户家中收集到一株软化病毒，其组织病理学特征和品种感受性与家蚕病毒性软化病不同 。 1976 年（渡部等，川濑和姜）研究表明它是与家蚕病毒性软化病病毒完全不同，是单链 毒，与早先发现的大蜡螟浓核病毒（ 似。 1978年前田 、渡部正式将该病毒称为家蚕浓核病毒（ 进入 20 世纪 80 年代又先后在中国镇江（ 982），日本山梨县（关 1983），长野佐久郡 (et 984)分离得到不同的株系 ,分别称为中国 (镇江 )株、山梨株、佐久株。因为这些株系在蚕品种感受性，物理化学特性，血清学特性方面相似，但与伊那株明显不同。 1986 年渡部等根据病毒在血清学特性的不同，把伊那株称为家蚕浓核病毒型（ 把中国（镇江）株、山梨株和佐久株称为家蚕浓核病毒型（ 蚕浓核病病毒的理化特性 单链线性的小型 子，长度大约 4 4结构蛋白。病毒无包膜，正二十面体对称，直径约 19分子的 为正链，或为负链，被分别包埋在不同的病毒颗粒中，在恰当的抽提条件下正链与负链退火形成 此早期曾被误认为是 et 977）。 理化特性方