【毕业学位论文】（Word原稿）牦牛种间杂交早期胚胎体外发育的研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级 ： 论文编号 ： 中国农业科学院 硕士学位论文 牦牛种间杂交 早期 胚胎 体外发育的研究 ak n ak n I 摘 要 本研究对影响牦牛种间杂交早期胚胎体外生产的几个重要因素进行了探索， 初步建立了牦牛种间杂交早期胚胎体外发育体系，为 探索异种配子受精的发育过程及犏牛受胎率低、流产率高的原因，提供有力的实验手段，为牦牛杂交改良提供科学依据，对西部牧业经济的发展具有重 要的现实意义。研究结果如下： 1抽吸法和抽吸加切割法采集牦牛和当地黄牛卵母细胞，抽吸法平均从每个卵巢采集的可用卵母细胞数（ S 显著低于抽吸加切割法采集的可用卵母细胞数（ S 2牦牛卵巢表面卵泡卵母细胞在成熟液 A（ 10% 75 青霉素 + 50 链霉素）中的成熟率（ 高于在成熟液 B（在 A 的基础上添加 成熟率（ ，低于在成熟液 C（在 A 的基础上添加 养 的成熟率（ ，但三者无显著差异（ P 这表明适量的 促进牦牛卵母细胞的体外成熟， 剂量超过一定浓度时对牦牛卵母细胞的体外成熟有不利影响。在成熟液 D（在 C 的基础上添加 17成熟液 E（在 D 的基础上添加 55 丙酮酸钠 ）中的成熟率（ 高于前三者，且 E 液的成熟率高于 D 液的成熟率，表明 55 丙酮酸钠促进牦牛 卵母细胞成熟。 E 液为本实验室条件下牦牛卵母细胞体外成熟的最佳培养液。 3牦牛卵巢表面卵 泡卵母细胞的成熟率（ 极显著高于牦牛卵巢内卵泡卵母细胞的成熟率（ P 4以 为受精基础液， 荷斯坦 奶牛冻精体外受精牦牛卵母细胞，精子浓度为 106106/的卵裂率（ 极显著地低于精子浓度为 4 106 6 106/0 106 60 106/的卵裂率（ P 后两者无显著差异（ P 精子浓度为 106 106/ 4 106 6 106/，种间 杂交胚胎的桑囊胚率（ 显著高于精子浓度为 40 106 60 106/的桑囊胚率（ P 精卵共培养 6h 的卵裂率（ 显著的低于精卵共培养 24h 和 48h 的卵裂率 (P 精卵共培养 24h 的桑囊胚率（ 高于精卵共培养 6h 和 48h 的桑囊胚率，但差异不显著（ P 因此，荷斯坦奶牛冻精体外受精牦牛卵母细胞，精子适宜浓度为 4 106 6106/精适宜时间为 24h。 5野牦牛冻精与牦牛卵母细胞受精的早期胚胎与输卵管上皮细胞共培养的桑囊胚率（ 高于与颗粒细胞单层共培养的桑囊胚率，但两者无显著差异（ P 这两者的桑囊胚率极显著高于在 中的桑囊胚率（ 0、 0）（ P 因此，与输卵管上皮细胞共培养，是克服牦牛胚胎 8 16 细胞期发育阻断的有效方法。 6 建立的牦牛种间杂交早期胚胎体外生产体系可使牦牛（母本）与 荷斯坦奶牛、西门塔尔牛、野牦牛（父本）杂交的卵裂率分别为 桑囊胚率分别为 甘肃当地黄牛（母本）与野牦牛（父本）杂交的卵裂率和桑囊胚率分别为 关键词： 牦牛， 种间杂交， 胚胎， 体外发育 of in of in On of of of of be of to of in as 1. of of or by a of of S by of P 2. of in ( 10% 75 + 50 , of in ( + ( + of in ( + 5.0 17 in ( + 55 t P BS of s 3 of of of P 4. O VM in of 106 106/ 106 6 106/ml 0 106 60 106/P of 0 106 60 106/ml 106 106/ml 106 6 106/P of h of 4h 8h of P of 4h of h 8h of t (P 4h of 106 6 106/of VM of in 5. VM of in VC of t OF of VC to 6of s . In VM of in of of VM of of in 录 第一章 绪 论 . 1 1 研究目的和意义 . 1 2 牛卵母细胞体外成熟的研究进展 . 2 卵母细胞发育、成熟的过程 . 2 卵母细胞成熟的分子机制 . 2 母细胞的体外成熟 . 4 母细胞体外成熟培养存在的问题与对策 . 9 3 精子体外获能的研究进展 . 10 子体外获能机制 . 10 响精子体外获能的因素 . 10 子体外获能的方法 . 12 子获能的检测 . 12 4 牛体外受精的研究进展 . 12 子的预处理 . 13 响卵母细胞体外受精的主要因素 . 13 种受精 . 15 常受精 . 15 外受精的培养系统 . 16 5 牛早期胚胎体外培养的研究进展 . 16 响早期胚胎体外发育的因素 . 17 期胚胎的体外培养系统 . 18 6 体外受精的应用前景 . 19 第二章 试验研究 . 20 实验一 牦牛卵母细胞体外成熟的研究 . 20 1 材料与方法 . 20 2 试验设计及统计分析 . 22 3 结果 . 23 4 讨论与分析 . 24 实验二 牦牛卵母细胞体外受精及受精卵的体外培养 . 28 1 材料与方法 . 28 2 实验设计及数据分析 . 30 3 结果 . 30 4 分析与讨论 . 32 第三章 结 论 . 37 参考文献 . 38 V 附 图： . 45 致 谢 . 47 作者简历 . 48 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 体反应 输卵管上皮细胞 输卵管上皮细胞 单层 血清白蛋白 丘 胞静止因 子 需氨基酸 皮生长因子 1777牛血清 卵泡激素 粒细胞 粒细胞单层 GV 发泡 发泡破裂 n 外培养 n 外发育 n 外受精 n 外成熟 n 外生产 LH 黄体素 丝分裂活化蛋 白 熟促进因子 99 培养基 199 必需氨基酸 成输卵管液 明带 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 1 研究目的和意义 中国牦牛饲养数量达 头，占全世界总头数 的 90%。 牦牛 是以青藏高原为起源地的特产家畜，也是世界屋脊的景观物种，被誉为“高原之舟” 。它 生活在海拔高 （ 3000m 以上） 、气温低 （年均温 0） 、昼夜温差大 （ 15以上） 、牧草生长季短 （ 110 135d） 、太阳辐射强 （年辐射量 586 816kJ/、氧分压低 （ 110下） 等严峻的自然条件下， 利用着其它牛种无法利用的牧草资源，并将其转化为肉、乳、皮、毛 （绒） 等多种畜产品 （ 陆仲璘 ， 1994）。 牦牛与普通牛种间杂交后代 （犏牛） 具有十分显著的杂交优势，如生长快、适应性强、犏牛产肉性能比牦牛高 产奶量高 两三 倍。 20 世纪 70 年代以来，人工授精技术 （ 在高寒牧区的 普 遍 推广、充分发挥优良种公畜改良作用、生产的犏牛比传统的牦牛生产性能有了大幅度的提高，特别是母犏牛，是高寒牧区 （荷斯坦奶牛不能适应生长的地方） 奶业的主要支柱。 目前，进行牦牛种间杂交， 繁殖犏牛 ，是提高个体生产水平和牦牛业经济效益的重要手段。 牦牛进行 种间杂交 ，在繁殖上遇到的问题：第一是受胎率低，据大规模杂交配种的统计，受胎率为 45%左右（ 39% 51%）比牦牛纯种繁殖的受胎率低 20%左右。受胎率低的原因，有人认为是由于所谓远缘杂交生殖隔离机制所致，是由于受精过程受阻，或者是由于胚胎发育不能顺利完成，当胚胎发育 到一定阶段时停止发育，胚胎被母体吸收或排除。至于牦牛 种间 杂交受胎率低的确切原因，目前还不清楚 。 第二是流产率较高，据统计流产率高达 20%左右，牦牛纯种繁殖的流产率一般为 3% 10%，显然远缘杂交流产率高，其中一部分是由于远缘杂交本身的原因造成的。 第三是 雄性犏牛不育 ， 可能 是 由于 牦牛和普通牛 遗传物质上有本质的差异 ， 使种间基因互相交流发生困难 而造成的 。 虽然牦牛、黄牛和奶牛染色体数目均相同 （ 2n=60） ， 但当来自不同牛种的配子结合成合子后，染色体之间相互不协调 ， 结果必然将影响相应性状的表达，造成生精能力的 丧失或减弱，导致雄性杂种不育 （中国牦牛学编写委员会， 1989） 。 哺乳动物的体外受精研究已有 120 多年的历史，先后在山羊、绵羊、小鼠、猫、猪、牛、狗、猕猴、黑猩猩等相继进行了体外受精研究并获得成功 （郭志勤等， 1998） 。随着体外受精研究的深入发展，自 80 年代以来，牛的体外受精技术已日趋成熟，建立 了 卵母细胞体外成熟（ in 体外受精 （ in 、受精卵体外发育（ in 体外受精 胚冷冻保存的成套技术。英国（ 1990）、日本（ 1992）和美国（ 1994）成立相关的公司，实现了牛胚胎生产的工厂化与商品化。 我国哺乳动物体外受精研究起步较晚 ， 但近年来发展很快，已先后在人和牛等 8 种动物取得成功。特别是人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平，每年有近千例试管婴儿诞生，数百头试管牛出生。 但牦牛体外受精研究却 寥寥无几 ，牦牛种间杂交（犏牛）的胚胎体外生产的研究更无先例。 牦牛种间杂交胚胎体外发育体系的建立，为探索异种配子受精的发育过程， 杂种雄性犏牛不育的机理 以及异种间细胞核、质互作 提供有 力的 实 验手段 。 同时可产生大量廉价的胚胎，为建立特有畜种胚胎库奠定基础。此外，我国西北地区草原的退化、沙化十分严重，快速繁殖犏牛，对提高良种覆盖率，发展质量型的草地畜牧业，减少载畜量，提高个体的生产性能和单位草中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 2 原面积的产品率，也具有 较高的社会、经济、生态效应。 2 牛卵母细胞体外成熟的研究进展 1935 年 ， 报道了从兔卵泡中分离出卵母细胞 ， 经体外培养使其继续减数分裂而 发育成熟。这里的“成熟”是指卵母细胞在体外继续进行减数分裂 ， 第一极体突出 ， 核染色体排列于赤道板上。 1978 年 获得了首 例体外成熟牛卵母细胞经体内受精后出生的后代。我国学者从 20 世纪 80 年代末开始家畜卵母细胞体外成熟培养的研究，并取得较大进展。 随着克隆、转基因、显微受精及试管动物的生产等现代生物技术的发展，对卵母细胞的需求与日俱增。哺乳动物 卵母细胞体外培养不仅为这些生物技术提供大量而廉价的卵母细胞，同时，也为卵母细胞的体内成熟提供了结构和生化研究的理想模型。 卵母细胞发育、成熟的过程 牛原始生殖细胞大约在 80d 左右（ H S et 1997）完成有丝分裂增殖期 ， 进入第一次减数分裂前期成为 初级卵母细 胞。之后，经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期。在双线期的后期 ，染色质高度疏松，外包完整的核膜，称为核网期 （ ，此时的细胞核又称为生发泡 （ 。很快，这些卵母细胞被一层扁平上皮细胞包围，成为原始卵泡 （ 。卵泡不断生长，但卵母细胞仍处于 ，一直到性成熟前。性成熟后，在促性腺激素或其他因子的作用下，这些初级卵母细胞才有可能恢复减数分裂，发生生发泡破裂 （ ，排出第一极体，并发育到第二次减数分裂中期 （ ，成为一个成熟卵母细胞，此时原始卵泡经初级卵泡、次级卵泡发育而成 为 成熟卵泡 （ ，又称为排卵前卵泡 （ ，以卵丘 卵母细胞复合体 （ 的形式从卵巢上释放 卵母细胞 （严云勤等， 1995） 。 牛成熟的卵母细胞将维持在 10 12h， 这个时期 称为牛卵母细胞可受精寿命（ 在此期间 均可正常受精，若超过 此期间 而没有受精子或其他因素的刺激， 牛 卵母细胞就会老化衰亡。 需要提及的是，并不是所有的初级卵泡或次级卵泡都能发育成为排卵卵泡，只有少数能发育成优势卵泡，大部分卵泡将在发育过程的各个时期发生退化闭锁。在性成熟前发生闭锁的卵泡要大大超过性成熟后。在接近卵泡发育后期，闭锁卵泡数也明显增加 （ et 1980） 。因而，从卵巢表面卵泡抽取的卵母细胞，有一些已经或正在发生闭锁，这 可能 是从卵巢表面抽取的卵母细胞中 有一些 裸卵或退化卵的原因（陈大元等， 2000）。 卵母细胞成熟的分子机制 卵母细胞的发育与成熟过程伴有几次发育停滞状态，第一次停滞状态是在第一次减数分裂前期的双线期，人们将处于这一时期的卵母细胞称为前期停滞的卵母细胞 （ ，自卵巢表面卵泡中抽取的卵母细胞就处于这个时期 （ 或核网期 ） 。此后，卵母细胞进入生长期，在体积上接近成熟卵母细胞，其物质储备也达到了一定的丰度时发生从 第一章 绪 论 3 期 ，即由 发生 M期转变 （ M ；第二个停滞则是卵母细胞成熟至 后，将在该期维持 较长时间，直到精子入卵或受其他人工刺激，卵母细胞才能离开 即 停滞。 牛卵母细胞成熟的 实质是一个复杂的减数分裂周期调控过程，许多分子参与了这个过程的调控。 母细胞核网期的阻滞 研究认为颗粒细胞及卵泡液的存在是卵母细胞 阻滞主要原因。卵泡液中的卵母细胞成熟抑制因子 （ 及环化腺苷酸 （ 均参与了这种阻滞。被证明是一种小分 子 肽，是由颗粒细胞产生并分泌到卵泡液中 （ A et 1900） 。有种属特异性 ， 体外成熟的研究表明， 其类似物 （如 8、磷酸二酯酶（ 降解 及嘌呤类物质 （如次黄嘌呤和腺苷） 等抑制剂均可阻止 发生 （ A et 1900） 。 母细胞生长的调控 在正常的生理条件下，卵母细胞完成生长期需 2 个情期，即 40d 左右（芮荣， 1996）。一方面表现为卵母细胞自身体积的增加，另一方面，表现为外部颗粒细胞的迅速增殖和分化。目前研究表明， 存在及基础水平的 以启动卵母细 胞进入生长期，而外部颗粒细胞的增殖分化， 是 卵母细 胞 自身体积增长的基础。另外生长分化因子 （ 及其 可诱导颗粒细胞的增殖与分化。颗粒细胞一旦开始增殖分化，就分泌大量细胞因子，如胰岛素样生长因子 （ 、碱性成纤维细胞生长因子 （ 、酸性成纤维细 胞 生长因子（ 、转化生长因子 和 （ 、白细胞介素 、肿瘤坏死因子 、干扰素 及抑制素、活化素等 （芮荣， 1996），这些因子对卵母细胞的生长起决定作用。这表明，首先是 及 导卵母细胞外颗粒细胞的增殖分化，然后增殖的颗粒细胞产生各类细胞因子促使卵母细胞的生长。 母细胞减数分裂恢复的调控 卵母细胞减数分裂恢复的调控涉及多种分子，如 黄体素） 、 熟促进因子，又称 M 期促进因子） 、丝分裂活化蛋白 )、 钙调素 （ 等，其中 调控 中发挥重要作用 。 调节亚基 （ 周期蛋白 B） 和 催化亚基 个部分组成 ，其 活性随着 的合成与消失而呈周期性变化 （翟中和等， 2000） 。牛卵母细胞体外成熟过程中， 在两次高峰 ， 一次是在培 养 后 12 14h，这一时间恰是 ；第二次高峰是在 培养后 20 24h，即 。 由此可见， 是 M 期达到高峰 ， 促进 发生和减数分裂的完成 。 一个重要作用是能使 底物 在 节下发生与 节下相同的磷酸化作用。这就会保证在第一次减数分裂完成后， 失的情况下，由 代其磷酸化作用，从而使卵母细胞在 间不会因为 活而发生停留，这正是第一次减数分裂与第二次减数分裂之间没有停息间隔的原因 （雷安民等， 1999） 。一定浓度的 合体抑制剂（ 能抑制 发生 （孙青原， 1994） 。这表明， 度的升高可能是恢复减数分裂的一个不可少的中间过程 ， 存在可能加强 微管系统形成的促进作用。 以使颗粒细胞与卵母细 胞之 间 的联系中断，从而解除了 卵母细胞成熟 的阻滞，使卵母细胞完成减数分裂而成熟 (G et 1993)。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 4 母细胞在 M 期 停滞 的调节 M 期的停滞主要是依赖 的维持。 胞静止因子） 和癌基因均可维持 稳定，在 停滞上发挥重要作用 （ et 1997） 。在上述物质中 作用更大一些，它可以同时激活 此，可以 说 是维持 滞的基础，其它因素只能通过影响 对 滞产生作用。 母细胞的体外成熟 母细胞的采集方法 宰牛卵巢卵母细胞的采集 从屠宰场 获取 淘汰母畜卵巢是体外受精研究中卵子的重要来源之一。从屠宰牛获取卵巢，必须在宰后 30取出卵巢，用生理盐水冲洗后，放入盛有灭菌的生理盐水或 保温瓶 （ 2530 ） 中，尽快（ 6h 以内）送回实验室，整个过程要求快速、无菌。 采集卵母细胞的方法有卵泡抽吸法、卵巢切割法、卵泡抽吸 加 切割法 等几种 。 （ 1993）证实采卵方法不同对采卵数及受精的囊胚发育率均会产生影响，研究发现常用的注射器吸卵，每头牛卵巢平均可得到 采用切割法采卵时则可以提高到 ，提高了一倍以上，同时用后一种方法获得的卵子进行体外受精，其囊胚发育率也略高于前者 。 母细胞的活体采集 （ 卵母细胞的活体采集是通过腹腔镜或超声波技术从活体上采集卵母细胞的新技术，是体外受精技术生产良种胚胎的一种主要途径。因从屠宰场收集得到的卵巢无法知道其系谱，其种质一般都相对较差。通过对良种动物反 复进行活体采卵，可获得大量种质优良的卵母细胞供体外受精生产胚胎，其胚胎生产的效率要比超数排卵高出数倍，且对动物的生产性能和生殖机能无不良影响。因此，活体采卵已成为当今推广应用体外受精和胚胎移植的一项关键技术。 响卵母细胞体外成熟的因素 物种类 和动物年龄 哺乳动物的种类不同，其卵母细胞体外成熟的时间、所需温度及培养基条件也不相同，成熟能力也有差异。同一种动物在不同年龄段其卵母细胞体外成熟的情况也有所不同。体外成熟的小牛卵母细胞体外受精后发育潜力低于成年牛卵母细胞。 （ 1998） 比较了小牛和成年母牛卵母细胞体外成熟的几项特征，发现 ： 小牛卵母细胞的平均 直径 （ ，比成年母牛的卵母细胞平均直径 （ 要小。 在体外成熟的最初 3h， 小牛卵母细胞代谢谷氨酸盐和丙酮酸盐的速率比成年牛卵母细胞要慢。但培养 24h 后，这两种 盐类在小牛卵母细胞中的代谢速度与成年卵母细胞大致相等。 两种卵母细胞体外培养的开始阶段，蛋白质合成很旺盛，之后下降。小牛卵母细胞体外成熟 9h 后，即可见蛋白质合成显著降低，而在成年牛卵母细胞中这 种现象则在体外成熟 24h 后才发生。 总之，不同年龄动物的卵母细胞体外成熟中的蛋白质合成、能量代谢等模式均有所区别。 母细胞类型和形态 实验室研究结果表明，带有完整卵丘细胞层的卵母细胞与卵丘细胞层不完整的卵母细胞相比，具有明显高的成熟率、受精分裂率和囊胚发育率。为排除卵母细胞本身质量的影响，将具有中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 5 完整卵丘细胞层的卵母细胞周围卵丘细胞去掉，结果亦发现其受精分裂率和囊胚发育率明显下降，这说明卵丘细胞层在卵母细胞体外成熟过程 发挥重要作用 。根据 (1989)的研究结果，细胞质不均一， 且带有黑斑的卵母细胞，其囊胚发育率明显低于胞质均匀的卵母细胞。因此，在挑选卵母细胞进行成熟培养时，应选择细胞质均匀的卵母细胞。 不同研究者对卵母细胞的分类不尽一致，谭景和等 （ 1989） 将从牛卵巢中抽取的卵母细胞分