【毕业学位论文】（Word原稿）嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白的分离和纯化农业昆虫与害虫防治硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 嗜线虫致病杆菌北京变种 株 杀虫蛋白的分离和纯化 o. y of I 摘 要 嗜线虫致病杆菌北京变种 (株是从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫 (肠道内所分离到的共生细菌，已经鉴定并定名。研究表明该菌株具有良好的杀虫活性。为挖掘这一本土细菌资源，本研究将其与另9 个昆虫病原线虫共生细菌菌株进行了杀虫活性比较，对 10 个不同来源的昆虫病原线虫共生菌菌株胞内和胞外产物进行分离，将各产物的可溶性蛋白提取，并分别进行生物测定，结果表明 此基础上以 株作 为研究材料，分离纯化其胞内和胞外的杀虫活性蛋白，建立一套纯化该活性蛋白的技术参数，并对杀虫蛋白的特性进行了初步鉴定。 现将主要研究结果总结如下： 1 测定的 10 个菌株发酵液均对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫有口服毒性，活性物质的产生部位在菌体胞内和胞外均有。不同菌种或同一菌种的发酵液、胞内或胞外产物和菌体碎片的杀虫活性不尽相同，一般胞内产物的活性要高于胞外。胞内胞外总蛋白的生测结果初步断定 10 个供试菌株所表现出的杀虫活性物质主要是蛋白类。 2 建立了一条有效纯化 株杀虫蛋白的技术路线，通过该纯化层析方案能获得纯化倍数较高 的目标蛋白。其基本参数包括： 硫酸铵盐析：最佳硫酸铵饱和度为 20 50；离子交换层析：使用 F 层析柱，洗脱低盐为 25高盐为 1 脱高盐体积范围 1530%；疏水层析：使用 脱高盐为 3 25低盐为 25凝胶层析：使用 6/10 层析柱，洗脱 5 通过该纯化技术路线所获得的目标蛋白浓度为 现出对棉铃虫初孵幼虫 生长抑制率。 3 从 株胞内和胞外所获得的目标蛋白 明分子量都大于 669泳带位置相同。该目标蛋白 明， 2 个目标蛋白都只出现一条分子量约为 220带。纯化该目标蛋白的层析技术完全相同。这说明 株胞内和胞外所产的目标蛋白可能是同一种蛋白。 4 目标蛋白的紫外吸收光谱在 250 290有吸收值。蛋白染色试验结果表明，目标蛋白 不是脂蛋白，也不是糖蛋白。 株发酵液中具有杀虫活性的物质为蛋白质，该种蛋白质具有较高的生物活性，严重抑制棉铃虫幼虫的取食和生长发育。本研究首次报道了 株胞内和胞外所产杀虫蛋白具有相似性，为开展胞内胞外杀虫蛋白的来源关系的研究奠定基础。本研究所建立的纯化该类杀虫蛋白的技术路线，为研究该菌株杀虫蛋白的作用机理以及为该杀虫蛋白基因的克隆提供了依据和基础。 关键词 ：嗜线虫致病杆菌；杀虫蛋白；生物活性；分离纯化 B6 is a of of It a To in . of 0 of It . a of of of of as 1. 0 of of a in of of of 0 2. A to of . of 0 F 5 is at 5 F 25 5 6/10 5 of . 3. of of . 69a 220kD of as 4. on 50of In it of of . a to It of In a to of . on of of 录 摘 要 . I . 录 . 一章 引 言 . 1 虫病原线虫共生菌 致病杆菌研究现状 . 1 病杆菌生物学特征 . 1 病杆菌分类 . 2 病杆菌所产生的活性物质 . 2 病杆菌安全性 . 3 病杆菌产生的杀虫物质研究进展 . 4 虫活性物质发现 . 4 虫活性物质产生 . 5 虫活性物质作用机理 . 5 虫蛋白的基因克隆 . 7 望 . 8 究目的和意义 . 9 究内容、方法和技术路线 . 9 究内容 . 9 究方法和技术路线 . 10 第二章 昆虫病原线虫共生菌 杀虫物质的分离 . 11 验材料 . 11 试菌株 . 11 试昆虫 . 12 养基和试虫饲料 . 12 要化学试剂 . 12 白质电泳试剂 . 12 验仪器 . 14 验方法 . 14 生菌的培养 . 14 酵液处理 . 14 菌株胞内和胞外产物的提取 . 15 V 同菌株胞内和胞外物质杀虫活性生物测定 . 15 内胞外粗蛋白的提取 . 16 内胞外粗蛋白浓度测定 . 16 内胞外粗蛋白电泳 . 17 内胞外粗蛋白杀虫活性生物测定 . 19 2. 3 结果与分析 . 19 同菌株胞内和胞外物质对甜菜夜蛾初孵幼虫的活性 . 19 同菌株胞内和胞外产物对棉铃虫初孵幼虫的活性 . 20 白浓度标准曲线 . 20 同菌株胞内和胞外粗蛋白浓度的比较 . 21 同菌株蛋白的 果 . 22 同菌株蛋白的 果 . 23 同菌株胞内和胞外粗蛋白对棉铃虫初孵幼虫的活性 . 24 结 . 25 第三章 嗜线虫致病杆菌北京变种 株杀虫蛋白的分离和纯化 . 26 验材料 . 26 试菌株 . 26 试昆虫 . 26 养基 . 26 验主要试剂 . 26 验仪器 . 27 验方法 . 28 株产活性物质最佳培养时间确定 . 28 酵液预处理和胞内胞外蛋白粗提液制备 . 28 淀目标蛋白最适硫酸铵饱和度范围确定 . 28 子交换层析纯化目标蛋白 . 30 水层析纯化目标蛋白 . 31 胶层析纯化目标蛋白 . 31 白样品浓缩 . 31 标蛋白纯度检测和纯化方案评价 . 31 果与分析 . 32 株产活性物质的最佳培养时间 . 32 淀活性蛋白的最佳硫酸铵饱和度 . 32 子交换法分离目标蛋白 . 34 水层析的结果 . 37 胶层析的结果 . 38 蛋白的纯度和纯化方案的评价 . 38 结 . 40 第四章 嗜线虫致病杆菌北京变种 株杀虫蛋白的鉴定和活性 . 41 验材料 . 41 试菌株 . 41 试昆虫 . 41 养基 . 41 验主要试剂 . 41 白质电泳试剂 . 42 验仪器 . 42 验方法 . 43 白质样品制备 . 43 内和胞外活性蛋白比较和活性带确定 . 43 虫蛋白的紫外吸收光谱 . 44 虫蛋白的鉴定 . 44 虫蛋白杀虫活性 . 45 果与分析 . 45 内和胞外活性蛋白比较和活性带确定 . 45 虫蛋白的紫外吸收光谱 . 46 虫蛋白鉴定结果 . 47 虫蛋白杀虫活性 . 48 结 . 49 第五章 结论与讨论 . 50 论 . 50 新点 . 51 论 . 51 参考文献 . 53 致 谢 . 59 作者简历 . 60 中国农业科学院研究生院硕士学位论文 第一章 引 言 1 第一章 引 言 昆虫病原线虫共生细菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌（ 1937）。该菌属肠杆菌科 ( 1979 )，革兰氏染色呈阴性。包括致病杆菌属（ 光杆状菌属（ et 它们分别与斯氏线虫属（ 异小杆线虫属（ 的线虫共生。共生菌与线虫互惠共生，线虫为细菌提供肠道内适生环境，将其 携带进入寄主昆虫血腔，并释放到血腔中，使共生菌获得充分营养迅速生长繁殖，产生毒素和抑菌物质， 48h 杀死寄主昆虫 ( 1993)；同时，共生菌能够为线虫分解昆虫体内物质，将其分解为线虫可以吸收的小分子物质，供线虫发育生长，并产生多种抑菌物质抑制其它杂菌生长，保证线虫生长繁殖的条件。线虫离体培养的 研究表明，共生菌的质量、数量、种群动态直接或间接地影响着线虫 本身 的质量和产量 （ 966； 994； 993； 995） 。 昆虫病原线虫共生细菌能产生多种活性物质，为寄主线虫提供一个适合生长的小环境，这一生物学特性，引起了有关学者的兴趣。 人们在此领域经长 期的研究中发现，该类细菌产生的多种代谢产物不仅能抑制多种细菌和真菌的生长（ 1980；杨秀芬等， 1998； 2001；杨怀文等，2000； ），还具有杀虫活性（ et 1995；王立霞等， 2000；刘峥等， 2002；李明华等， 2003；潘映红， 2004）和抑制肿瘤细胞生长的活性（ 1998； et 2001； 刘卫京等， 2002）。因此从该类特异生境细菌中寻找具有新活性、新功能的研究已成为国内外科学家关注的热点。 虫病原线虫共生菌 致病杆菌研究 现状 病杆菌生物学特征 致病杆菌 (一类兼性厌氧、化能异养的革兰氏阴性细菌，该菌寄生于斯氏线虫(道内，与线虫互惠共生，属肠杆菌科 (共生菌与线虫存在着高度的共生专一性。在自然条件下，一种线虫只能与一种共生菌共生（ 1990），而一种共生菌可与几种线虫共生，如共生菌 与 S. S. S. 线虫共生。 型态变异是致病杆菌的一个重要特征。根据其在琼脂培养基上产生菌落的形态以及它们在鉴别培养基 吸收染料的能力不同，可分为型和型（ 980）。 （ 1993）通过对 谱分析证明， 两个菌型同源性差异不显著。 刘峥（ 2003）通过对嗜线虫致病杆菌北京变种 株的 I、 菌 16列分析后发现，通过对 纹图谱分析，得到相似系数 说明二型的 在微小差异。大量研究已证明，线虫和 I 型菌一起培养时，其产量明显高于与 菌 起培养时的中国农业科学院研究生院硕士学位论文 第一章 引 言 2 产量（ 1990）。这是由于型菌较型菌更易利用外界营养物质为线虫提供更好的生存环境。在离体培养条件下，共生菌易发生型态变异。型菌和 菌所产代谢物及其生物活性也存在明显差异，型菌产生的活性物质高， 菌产生的活性物质低甚至没有，因此，要想获得稳定的、高活性物质，必须控制共生菌的型态变异。致病杆菌发生型态变异的机制目前尚不完全清楚，但其型态变异引起产 生一系列活性物质的不同，使得致病杆菌型态变异的机制研究越来越受到重视。 病杆菌分类 1959）最早报道从昆虫病原线虫 内分离到 具有抑菌活性的共生菌菌株 来才定名）。早期的共生菌分类主要依据寄主线虫的种类。随着昆虫病原线虫分类地位的不断改变，共生菌的分类地位也产生一系列的变动。 1979）根据形态和生理生化特征，将共生菌归在肠杆菌科下，并将其命名为 一个新属 致病杆菌属（ 当时仅包含两个种 X. X. 且只能分别从两个线虫属 分离获得。 1988）测定了 21 个菌株（包括、型）的 240 项表型及生理生化指标，采用数值分类的方法将 X. 亚种上升为种的水平，形成 5 个种： X. X. X. X. 1990）利用寡核苷酸探针与 16S 列可变区的互补性，证明了 致病杆菌 区分为 5 个种的可行性。 1993）通过 交实验及生物学特性的不同，正式将共生菌分为两个属：和斯氏线虫共生的定为 异小杆线虫共生的定为 确定了致病杆菌中已定名的有 5 个种。后来随着共生菌资源的逐渐丰富以及分类技术的不断改进，目前 定名了 9 个种。 病杆菌所产生的活性物质 （ 1）抑菌物 质 上世纪 90 年代研究证明，昆虫病原线虫共生菌所产生的抑菌物质可以抑制多种病原细菌、酵母菌和真菌的生长。主要包括 藤黄微球菌 黄色葡萄球菌 状芽孢杆菌 粘芽孢杆菌 B. 草芽孢杆菌 B. 云金杆菌 B. 肠杆菌 雷氏菌 普通变形杆菌 光假单孢菌 腐欧文氏菌 索氏志贺氏菌 ，此外对多种植物病原真菌具有较强的抑制活性，加拿大科学家 (1994)研究发现致病杆菌属中的 2 种共生菌发酵液对 7 种植物病原真菌具有良好的抑菌效果，其中波氏致病杆菌（ 谢物对 P. 杨秀芬 等报道 （ 1998） 致病杆菌的 5 个供试 菌株 代谢产物 对 9 种 植物病原菌有较强的抑制 作用， 对