【毕业学位论文】（Word原稿）二化螟Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N和钙粘蛋白基因的克隆及在昆虫细胞系的表达昆虫毒理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 二化螟 素受体蛋白 氨肽酶 N 和钙粘蛋白基因的克隆及 在昆虫细胞系的表达 (I 摘 要 二化螟 严重威胁我国 水稻生产的 重 要害虫。 近年来，受 耕作制度和种植结构的改变、高产优质水稻品种的大面积种植 、天气等原因 的影响 ，二化螟的发生逐年加重，而且由于 化学农药长期大量反复的使用， 使 其 抗药性明显上升 ，更加难以防治 。转 因水稻的出现为防治二化螟提供了新的有效的方法 ， 但是从生物学角度来看，昆虫对转基因作物产生抗性是一种胁迫进化现象 。因此，研究 杀二化螟的机理、 二化螟 对 生 抗性 的 可能机制，可以为将来转基因水稻 的 推广 、 制定 抗性 治理 策 略 、延长转基因水稻的 使用期限 等 提供 重要 的理论依据 。 本论 文研究了 二化螟 素的主要受体 氨肽酶 N（ ， 钙粘蛋白 （ ， 利用 合 术 的 方法 得到 了 二化螟 中肠 钙粘蛋白 基因 的 全长序列 ，并在昆虫杆状病毒表达系统中成功的进行了表达 。 主要结果如下： 利用 合 术的 方法 得到了二化螟中肠 氨基氨肽酶 N 基因的全长序列 ， 同时 利用 术得到 钙粘蛋白基因的全长序列 。 其中 数据库比对鉴定为氨肽酶 N 基因家族的1 个成员，其基因全长 已在 记， 登录的序列号为： 基因全长 3292码 1075 个氨基酸， 其 C 端有一段 25 个氨基酸组成的片段 ， 具有亲脂性 和跨膜特性 ； 钙粘蛋白基因 在 录的序列号为 ： 因全长 5148编码 1715 个氨基酸 ，有16 个钙粘蛋白重复 域 ，与 欧洲玉米螟等其他鳞翅目昆虫 钙粘蛋白具有较高的同源性 ，同源性达73%。 昆虫杆状病毒表达系统作为四大表达系统之一，已广泛应用于重组蛋白的表达。该系统具有许多优点，如多角体启动子控制下的高效表达，比较完善的转录后加工修饰，容 易从细胞中纯化，无内毒素污染等。将 钙粘蛋白的 基因 克隆 到 达系统中杆状病毒转移载体多角体基因启动子的下游，筛选出重组质粒 的基因； 并转化大肠杆菌 体内进行重组，经抗性和蓝白斑筛选，获得杆状病毒重组载体 的基因 ； 转染粉纹夜蛾（ 胞（ 获得含 目的 基因的重组杆状病毒，重组病毒感染 胞后，得到表达的蛋白。 经过 析和 点 杂交 结果 显示， 钙粘蛋白 基因 在昆虫杆状病毒表达系统中 得到了表达 ，且 均 为 受体蛋白。 关键词 二化螟， t)， 受体 蛋白 ， 氨肽酶 N（ ）， 钙粘蛋白 ( 杆状病毒表达系统 he is a on C. of of of . to it to be t a to of to is a of t in . t to of t . t in t In ( t . PN CR as PN CR PN a of by in PN PN 292 075 a 25 in of of 148 715 6 to As of in of as by of of PN or It B e+, of of of PN of ， 目 录 第一章 引言 . 1 化螟的危害及转基因水稻的发展 . 1 t 毒素的杀虫机理 . 2 内外 体的研究进展 . 4 肽酶 N（ . 5 粘蛋白（ . 6 性磷酸酯酶（ . 8 动蛋白 (. 8 酯 (. 8 术 . 8 虫杆状病毒表达系统 . 10 论文研究的目的与意义 . 12 第二章 研究内容和技术路线 . 13 要研究内容 . 13 隆 因序列及序列分析 . 13 胞系中的表达及功能鉴定 . 13 究的技术路线 . 13 究的技术路线 (图 . 13 究的技术路线 (图 . 14 第三章 因的克隆及序列分析 . 15 验材料和方法 . 15 料和试剂 . 15 菌培养基 . 15 粒 提液 . 15 脂糖凝胶电泳缓冲液 . 16 要试剂 . 16 器设备 . 16 验方法 . 17 提取 . 17 转录 . 17 因克隆引物设计 . 18 物的纯化回收 . 19 化产物与 体连接 . 19 化 . 20 粒 提取 . 20 定 . 20 列测定 . 21 果与分析 . 21 因的克隆、鉴定 . 21 列结果与分析 . 23 论 . 32 第四 因的克隆及序列分析 . 33 验材料和方法 . 33 验方法 . 33 提取 . 33 转录合成 . 33 因克隆引物设计： . 33 物的纯化回收 . 34 化产物与 体连接 . 34 化 . 34 粒 提取 . 34 定 . 34 列测定 . 34 果与分析 . 35 因的克隆、鉴定 . 35 酸序列结果与分析 . 35 论 . 49 第五章 表达及鉴定 . 50 料和试剂 . 50 料 . 50 要试剂 . 50 分储存液配 方 . 50 验方法 . 52 切重组和供体质粒 . 52 收 . 52 收产物酶切 . 53 收 . 53 接 . 53 化 . 53 粒 提取 . 54 酶切鉴定 . 54 制作 . 54 . 55 单菌落 . 55 取重组 . 55 定 . 55 转染 . 56 蛋白的纯化 . 56 白鉴定 . 57 果与分析 . 58 组转移载体 构建 . 58 组杆状病毒的鉴定 . 59 组杆状病毒转染 胞 . 60 因在昆虫 胞中的表达 . 60 论 . 62 第六章 主要结论 . 63 1. 首次克隆了二化螟的 因 序列 . 63 2. 克隆了二化螟的 因序列 . 63 3. 利用杆状病毒昆虫表达系统表达 . 63 参考文献 . 64 致 谢 . 72 作 者 简 历 . 73 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 氨肽酶 N 状缘膜囊 43状病毒表达系统 溴 3吲哚 bD半乳糖苷 血清蛋白 云金芽胞杆菌 粘蛋白 化 乙 锭 大霉素 脂酰肌醇锚 丙基 代半乳糖苷 那霉素 碱基对 道尔顿 化硝基四氮唑兰蓝 OD 光度 酸盐缓冲液 合酶链式反应 二烷基苯磺酸钠 环素 X溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 化螟的危害及转基因水稻的发展 二化螟 属于鳞翅目 蛾科 ( 草螟 亚科( 禾草螟属 ( 是世界性重要农业害虫 ，广泛分布于亚欧大陆多个国家，在我国南方、北方各稻区都有分布。二化螟是水稻等禾本科作物钻 蛀性害虫，食性较杂，除危害茭白、甘蔗等作物外，更是严重威胁着水稻生产的主要害虫 。 二化螟具有越冬场所多，转株危害等特点，危害分蘖发棵期水稻，造成枯鞘和枯心；危害孕穗和抽穗期水稻，造成死孕穗或白穗；危害乳熟期水稻，造成虫伤株，被害严重时倒伏 （ 卢代华 等 ， 2004） 。 我国稻螟为害的确切记载始于 1022 年 ， 20 世纪 50 年代中期以前 ， 以二化螟 危害 为主 ， 此后十几年中 ， 三化螟 遍大发生 ， 70 年代 ， 我国螟害轻微 ，自 70 年代中期推广种植杂交稻后，除华南部分稻区仍以三化螟 为害为主外，长江流域广大稻区，二化螟 发生、危害 呈明显上升 趋势 ，为害逐年加重，已经成为杂交水稻上最重要的害虫。 1993 年 ， 二化螟急剧回升 ， 三化螟也随之回升 ， 1996 年 两 种稻螟大发生 ， 此后连年暴发成灾目前我国螟灾的主要特点是虫口密度高、受害范围广、受害程度重、持续时间长、经济损失大 。 螟灾 全国年发面积约1500 万 防治 约 3800 万 。 估计年防治代价约 60 亿元 ， 残虫造成作物损失近 65亿元 ， 总经济损失约 115 亿元 。 由此可见 ， 当前稻螟已取代稻飞虱、棉铃虫成为影响我国国计民生的头号害虫 （ 盛承发 等， 2003）。 因为耕作制度和种植结构的改变、高产优质水稻品种的大面积种植 ， 以及天气等情况的影响 ， 是 稻螟种群数量呈回升趋势 的主要原因 ，而且 化学农药的长期大量反复的使用， 使 稻螟的抗药性明显上升 ，防治更加困难 。 同时，由于化学杀虫剂的大量施用，不但增加水稻生产成本，而且 给环境带来了负面影响， 造成了环境污染、农药残留等问题 ， 破坏了自然界的生态平衡，给人类的身心健康带来了威胁， 更 严重阻碍了农业的可持续发展。 苏云金芽胞杆菌 (前被全世界广泛应用于害虫防治工作。杀虫晶体蛋白 (称内毒素（ (黄大昉 等 ， 2001)是苏云金芽胞杆菌的主要活性成分。 敏感昆虫有强烈的毒性，而对高等动物和人无毒。现在 翅目 鞘翅目 昆虫，此外，研究还发现 膜翅目、同翅目、食毛目的多种害虫及植物病原、线虫、螨类和原生动物也有控制作用（ et 1998）。 由于 生的杀虫晶体蛋白对昆虫具有专一、高效和对人畜安全等优点，使其相关基因成为目前应用广泛的抗虫基因。自 1987 年，比利时和美国的科研人员分别将 因转入烟草和番茄以来， 国外 先后获得了棉花、玉米、马铃薯、烟草、水稻、番茄等 40 多种能够高剂量表达转基因植物，我国也先后将 因转入了烟草、甘蓝、棉花、玉米和水稻等作物 (黄大昉 等 ， 2001)。转 因棉花在我国于 1997 年开始商业化种植，到 目前 种植面积已 超过 400 万公顷，占棉花总播种面积的 三分之二以上 。 目前 转基因抗虫水稻的商业化种植 是 国内外广泛关注 、讨论 的热点问题 ， 转基因抗虫水稻的遗传转化、基因漂流、靶标害虫的抗性风险、对非靶标生物和稻田节肢动物群落的影响以及 士学位论文 第一章 引言 2 杀虫蛋白在土壤中的残留等方面的研究 已广泛开展。 现有研究表明 ， 稻对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等主要靶标害虫具有较高的抗性水平 ， 对稻飞虱、叶蝉、捕食性天敌等非靶标生物的生长发育和稻田节肢动物群落的稳定性无明显影响 ， 靶标害虫的抗性和转基因水稻与杂草稻、野生稻之间的基因漂移风险是转基因抗虫水稻商业化种植的主要环境安全问题 （ 韩兰芝 等， 2006） ，但是关于转基因水稻对靶标害虫的抗性风险评估 等 问题还 很少研究 。 由于转入的抗虫基因在植株体内持续表达，能有效的 、 持续较长的时间对整个植株起到保护作用，可显著降低农药的用量，并且专一性很 高 ， 能与其它 防治方法一起作为害虫综合防治 体系的主要措施 ，具有很高的经济价值 （ 张少燕， 2002） 。但是这样就 使得 昆虫 在整个生长周期都受到 虫蛋白的高压选择，存在产生抗性的可能 ， 直接 威胁各种 剂、 转 因作物 的使用寿命。 自 1985 年 1985） 首次报道 了 印度谷螟 剂产生了抗性； （ 1990） 在田间发现小菜蛾 剂产生 了 抗性 ； 2001） 在 澳洲新南威尔士和昆士兰州 田间抗性监测中发现 棉铃虫 H. 能够在 （ 2004） 报道粉纹夜蛾 温室对 剂产生抗性。 而室内筛选实验 则表明了 有更 多种昆虫可以对 虫剂或 转 因 植物 产生抗性，