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文档简介

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 硕士学位论文 鸡传染性支气管炎重组鸡痘疫苗 免疫效力的研究 摘 要 鸡传染性支气管炎 (是由冠状病毒属的冠状病毒引起的高度接触性传染病 ,是严重危害养鸡业的重要疾病之一。我国在防制鸡 传染性支气管炎过程中,目前通常采用马萨诸塞( 清型疫苗 52,还有许多由地方分离株通过鸡胚致弱制备的商品化活疫苗。但由于我国大量鸡传染性支气管炎病毒不同血清型的出现,对感染异种 离株而发病的免疫鸡群不能提供完全的保护作用,造成了我国免疫鸡群中 繁发生的原因之一。禽痘病毒载体疫苗在生产实践中已被证实为一种安全有效的疫苗,部分产品已经投入使用。本课题组已构建 期试验效果良好。本研究对其免疫效力进行了重组鸡痘病毒疫苗同弱毒疫 苗比较试验、最小免疫剂量测定、安全性、遗传稳定性、不同条件保存对疫苗效价的影响等工作,为疫苗进一步的中试和推广作铺垫。 为了检测重组病毒的遗传稳定性, 鸡胚成纤维细胞接种传代至 30代,取第 15、 20、 25、 30 代重组病毒作为受检代次。病毒蚀斑检测证明,重组病毒的效价在 2105上下波动, 色后所有蚀斑均呈蓝色;提取重组病毒基因组 别用 鸡 干扰素基因基因特异性引物进行 增, 4 个代次的重组病毒 检测到了大小分别为 660 500的片段,在重组病毒 也均检测到了 660 因特异性片段,序列测定表明 2 个外源基因在细胞传代过程中没有发生核苷酸和氨基酸的改变;间接免疫荧光检测显示各代次重组病毒中插入的外源基因均能表达,在荧光显微镜下观察到了特异性荧光。结果表明,重组鸡痘病毒具有较好的遗传稳定性,经过 30 代的传代后外源基因能够稳定表达。 将共表达传染性支气管炎病毒 膀内侧无血管处接种 1 周龄 (相当于 05)。结果表明,即使采用原倍重组疫苗注射试验鸡也不会引起试验鸡发病,重组疫苗对试验鸡是安全的。 将 100 只 4 周龄 分为 4 个组,分别免疫 并设 照,免后 4 周用 攻击。结果 13/22 的鸡免疫 能获得保护, 疫组和 保护率分别是 18/24 和 17/22。 疫后能缩短 吸道排毒时间及病毒抗原在肾脏组织中存在时间,仅在攻毒后的 6以在喉拭子和肾脏组织中检测到 病毒和病毒抗原,比 毒疫苗免疫组分别缩短了 2d。 毒疫苗和重组鸡痘病毒免疫组肝、脾、肾、肺和气管的病理变化轻微, 疫组在攻毒后的第 16d 观察到病理变化,比 毒疫苗免疫组攻毒后病变持续时间短了 淋巴细胞亚群的监测表明,疫苗接种后 3 周全部实验鸡均为 体阳性,其中, 毒疫苗免疫组抗体水平最高,其次是 疫组, 疫组的抗 体水平最低。除了 疫组 淋巴细胞攻毒前下降较为明显, 淋巴细胞比例是最高的,其余各免疫组外周血 、 和 巴细胞变化水平比较平稳。上述试验结果说明 进了 淋巴细胞的成熟,抑制外周血中 淋巴细胞数量。提高了机体的细胞免疫水平,限制了机体 B 淋巴细胞的活化以及特异性抗体的产生;同时,能抑制活疫苗免疫接种引起的试验鸡增重降低作用, 免疫试验鸡的增重没有受到疫苗接种的影响,与 毒疫苗免疫组有显著差异。 别 10 倍滴度稀释后接种 4 周龄 ( 104、103、 102、 10),免后 4 周用 攻击。结果表明 ,疫后,当免疫剂量大于 100, 疫组的保护率在 72%以上。最高可以达到 疫后,不同剂量( 101001000 10000疫组对 强毒攻击的保护率在 60%间 。 同时将重组鸡痘疫苗分别放置于 、 4 和常温条件下保存 ,测定其疫苗效价是否变化。结果表明重组鸡痘冻干疫苗在 条件下保持 1 年效价变化甚微 , 在 4 条件下保存 6 个月时病毒效价将下降 1 个数量级。 以上结果表明: 传染性支气管炎具有较好的保护率,该重组病毒可以做为预防鸡传染性支气管炎的后选疫苗株。 关键词 传染性支气管炎 鸡痘重组疫苗 最小免疫剂量 遗传稳定性is in an is to an in BV BV to BV 120 52 of IB in is as a is is 0 in 5 、 20、 25 by 1 by no in 5202530th of PF 0 5PF BS(X4 3 2 in or B 8/24 7/of a of in in 120 be in 120 be 6 of BV no by no on of it is 120. 135 PF 1 104103102 10 5 10403102 10 as X4 of 2%, of 0%of 10320 ,4 it is 20 ,it be a be as 国农业科学院硕士学位论文 V 目 录 第一章 引言 . 1 传染性支气管炎概述 . 1 国内外研究现状 . 1 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展 . 2 鸡传染性支气管炎疫苗的研究进展 . 5 干扰素的研究进展 . 8 型干扰素 . 9 型干扰素 . 9 生物学作用 . 10 制病毒复制的作用机理 . 11 基因工程干扰素的应用研究 . 11 病毒与禽痘病毒载体在传染性疾病上的应用 . 11 禽痘病毒作为载体的特性 . 12 禽痘病毒载体的应用 . 13 第二章 重组鸡痘病毒免疫效力的研究 . 16 染性支气管炎重组鸡痘疫苗遗传稳定性试验 . 16 材料与方法 . 16 重组病毒的安全性试验 . 17 重组病毒的传代 . 17 结果 . 18 染性支气管炎重组鸡痘疫苗与常规弱毒疫苗免疫效力的比较 . 20 免疫试验设计 . 20 结果 . 22 染性支气管炎重组鸡痘病毒疫苗最小免疫剂量测定 . 32 免疫试验设计 . 32 结果 . 33 苗的保存期试验 . 36 重组鸡痘疫苗效价测定 . 36 结果 . 36 论 . 38 第三章 全文结论 . 42 参考文献 . 43 致 谢 . 53 作者简历 . 54 中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 1 第一章 引言 传染性支气管炎概述 国内外研究现状 鸡传染性支气管炎 (由传染性支气管炎病毒 (起的鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病。主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统等。 鸡感染后常由于呼吸道或肾脏病变而引起死亡;产蛋鸡感染后产蛋 量和鸡蛋品质下降 , 甚至死亡;肉鸡生产能力下降。同时 ,使饲料报酬降低,死淘率增加,给世界范围内的养鸡业造成了很大的经济损失 。 本病最早于 1931年由 种显然地新的鸡呼吸道疾病”,主要危害2日龄到 3周龄雏鸡,特征是喘息、精神倦怠,死亡率为 40% 90%; 1936年, 早的报道表明: 来证实也危及育成鸡和蛋鸡,使其抵抗力降低,产蛋量和蛋品质下降。 20世纪 40年代,传染性支气管炎主要以呼吸道症状、产蛋量下降为主(呼吸型)。 1962年, B,证明 由肾致病性 脏肿大、苍白,肾小管和输尿管有尿酸盐沉积,外观呈现典型大理石条纹状的“花斑肾”。 1985年, 株 命名为 毒株除引起气管、肾脏和生殖道等病变外,对肠道有较强的亲和力,造成肠道损伤。 1991年,在英国报道了由 1株 呼吸症状、肾脏病变和肌肉坏死等为主的变异传支, 93/B, 1。后来证明这 2株属于同一血清型。传支的发生和流行呈世界分布,几乎所有养禽国家和地区均有该病发生。 1956年 951年分离的康涅狄格株( 下简称 1941年分离的马萨诸塞株( 下简称 引起类似的疾病,但不能交叉保护或交叉中和,从而证明 1997)。目前,美国已报道的鸡传染性支气管炎病毒的血清型主要有: 殷震 等 ,1997;. et 1997;et 2001b;et 2003)。 我国于 1972年由邝荣禄首次在广东省发现肾型 荣禄等, 1982) , 1990年李康然在广西分离了一株肾致病性 康然等, 1990) 。 90年代以来,肾型 流行十分广泛。王永坤、王玉东等报道了发生在我国江苏省和山东省的腺胃型 骏弓( 1999)等在辽宁地区分离到一株嗜肠型 1996年以来,不少地区报道了一种主要引起腺胃病变的中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 2 传染性支气管炎(腺胃型 病原方面的研究还在继续进行。发病鸡 出现以生长阻滞、消瘦、腹泻,剖检表现为腺胃肿大、腺胃壁增厚、腺胃粘膜出血溃疡、腺胃乳头平整、融合为特征的病理变化。目前,肾致病性 且在我国免疫鸡群和非免疫鸡群中有新基因型的肾致病性 004) ;而且还分别从家养孔雀和鸭子的肺和心脏样品中分离出 H/3和 H/3两株禽传染性支气管炎病毒 (2005)。 鸡传染性支气管炎病毒的分子生物学研究进展 传染性支气管炎病毒 鸡传染性支气管炎属冠状病毒科( 冠状病毒属( 有囊膜,为不分段的单股正链 1989)测定了 基因组长 度为 27608个核苷酸 , 为第一个全序列测定的冠状病毒。不同毒株的基因长度有不同程度的差异。病毒粒子略呈球形,直径约 80 120时呈多形性。 膜来自宿主细胞的内膜(高尔基体膜或粗面型内质网),为双层脂膜,囊膜上有许多梨状纤突,纤突长约 20放射状排列;囊膜内含两种病毒糖蛋白 膜蛋白和纤突蛋白。核衣壳呈螺旋状、较长,直径约 9 16正链基因组 1997;殷震等, 1997)。 端有帽子结构, 3 端有聚腺苷酸化 ()尾 , 其中至少有 10个明显的开放阅读框架 (编码相对分子量约为 440已确定的 1)别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。 端有 200 其末端为先导序列 ( 析发现 , 正链 5 端的非编码区和负链 5 端之间有十分明显同源性 先导序列的侧翼还有一段很保守的八核苷酸序列 启动 基因组 端序列之间有高度同源性 ,均含 此, 并与之分离 , 然后重新结合在模板下游的适当位置上 , 作为亚基因组 感染 期 在晚期 负链 条 这些 末端,形成嵌套式结构,其中 C、 N)膜基质蛋白 (M)纤突蛋白 (S), 其比例为 N:M:S=15:6:1(摩尔数之比 ), 其余的编码一些功能尚不清楚的小分子蛋白。 构蛋白及其功能 纤突蛋白( S) 编码 , 位于病毒粒子最表层的囊膜上,是构成病毒纤突的主要成分,是由2白包含两种糖多肽 2,具有非常重要的生物中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 3 学 功能:蛋白与宿主细胞膜上糖蛋白受体的结合,使 有 1和 毒囊膜才有融细胞膜的活性;( 2)可诱导血凝抑制抗体和中和抗体( 端决定 3) 4) 免疫优势,并在大多数 作为 5) 1蛋白上,其 性的作用。 膜基质蛋白( M) 是 所编码, 端位于病毒离子外部并被糖基化,其主要组成部分跨膜三次, 部分在囊膜的内侧面,仅有一小部分糖基化的 , 端有两个糖基化位点。 病毒装配时与核衣壳相互作用并将核衣壳结合到囊膜上的作用,对 核衣壳蛋白和纤突蛋白相比,其免疫原性最低,然而,也有报道认为 原决定簇,但其免疫生物学功能,尤其是该蛋白在病毒致病过程中的作用及其与病毒的组织嗜性的关系还需要进一步研究。 核衣壳蛋白( 病毒总蛋白量 40%,在进化上保守。装中有重要作用。 而这种相互作用不是随意的,结合部位要求有一定序列或特殊结构。尽管这种特异性可能由一级结构所指导,但 3, 测存在发夹结构,与结合的特异性有关 ,二级结构和碱基对的作用也不容忽视。从氨基酸序列推测 须通过不依赖于锌指结构的机制结合到 测可能是多价 以蛋白浓度增加能导致 着病毒蛋白结合到基因组 细胞免疫免疫和体液免疫中起重要作用。据 对 蛋白的单抗具有病毒中和活性,表明在 蛋白或其片断, 用表达的融合蛋白首先免小鼠和鸡,均能引起对 表明 细胞对完整的 时也能激活 强 子量 与 成病毒样颗粒( 后者在 病毒的复制过程中, 基因转录相关序列,这段序列 常在序列中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 4 分析中用作为 非结构域 有 1a、 1相应表达的产物为 44000根据普遍存在于冠状病毒的核糖体移码规律,在 结”结构的促使下,则应表达一个约741a 1后再被细胞内 蛋白酶裂解为相应的功能蛋白。 1一个 33一个类生长因子受体区( 进一步的序列分析表明, 937 9357100 14789者都在病毒复制中发挥重要的作用。 a、 3b、 3相应的表达产物分别为 中 3c 码 疏水的氨基酸组成特点揭示了该 可能与病毒的复制有关; 其相应的表达产物大小为 中 5个氨基酸中亮氨酸为 17个,约占 26,显示了强烈的疏水性,与囊膜相连,但它不具备一个常规的跨膜区域。 浆内完成,毒粒通过囊膜上的 吸附在细胞表面,以细胞膜与病毒囊膜融合或内吞方式进入细胞。病毒基因组一旦进入细胞,便在胞浆内完成其复制的生物学过程。作为一种正链 5, 端翻译病毒特异的早期依赖于 990),而是按照特殊的模式,该 5, 端有一段 )序列,然后以负链过另外一种依赖 引物转录模式 (成得到的。即 :先导 先到序列)从负链板 3, 端转录出来后,与模板链(即负链 离,但继续与 先导物 遇到与先导 此为识别信号,重新结合模板链,并以先导 录出一条亚基因组 过上述不同 结果得到一 套长度递减的 磷酸化后与新合成的基因组 基化过程则要等多肽运转到高尔基体后才能进行。 以多肽合成后,马上就插入粗面内质网膜,边转译边插入粗面内质网膜; 高尔基体中参与毒粒合成。过剩的 1和 证据表明,高 尔基体或细胞膜是最可能发生这一过程的部位。一般情况下,不经过切割的 et 986)。 病毒结构蛋白在细胞内的积聚是病毒粒子装配的先决条件。可能是通过发出信号使病毒毒颗粒组装起始于基因组 学位论文 第一章 5 作用形成核衣壳,随后启动病毒蛋白质 白质 毒核衣壳在内质网尚出芽,并在此过程中,获得双层质膜和 熟的病毒粒子被转运到了高尔基体并经过修饰后,被包入滑 壁囊泡中,释放胞浆。毒粒从细胞释放的机制可能有两种方式,一是从裂解的感染细胞中直接释放;二是含毒粒的泡囊被转运到细胞边缘,然后通过分泌或融细胞膜作用从细胞中释放出来,不会造成宿主细胞裂解。 鸡传染性支气管炎疫苗的研究进展 毒疫苗 在使用的弱毒苗中以荷兰株 120应用最广泛 , 且有较好的免疫保护性 , 其次是 毒致弱的疫苗株。活疫苗能有效刺激机体的免疫系统 , 激发体液免疫和细胞免疫 , 同时使用方便 , 生产成本低。 1986) 将商业化 的 州 41株疫苗在鸡肾组织培养物中传代到 40代 , 继而用 结果这两个弱毒疫苗的免疫效果互不影响 , 从而能有效地预防雏鸡感染传染性支气管炎。但鉴于 弱毒疫苗有可能成为其突变的主体和重组变异的供体 , 且其易引起严重的上呼吸道支气管反应 , 特别是对于 1日龄鸡。同时肾型与支气管炎型的免疫机制还存在着很大的差别 , 这在很大程度上亦影响着疫苗的免疫保护作用 , 这使得致弱活毒疫苗在理论和实践上都不可能从根本上彻底控制 活疫苗 1977年)就报道了用油乳剂灭活苗使 但是 , 由于 单价灭活苗并没能阻止 后 , 990)等研究表明 王红宁等 (1999)对我国 变异株占 提出了用不同血清型毒株多价灭活疫苗预防本病更为有效的科学依据 , 在国内率先研制出了多种多价油乳剂灭活苗。区域试验证明 , 该疫苗对鸡 安全无副作用 , 并能有效地预防 活疫苗的不足之处是使用剂量大 , 需要配合佐剂 , 制备过程比较复杂 , 因而成本较高 , 即使全病毒灭活苗也需 2次以上的加强免疫方能有效引发中和抗体的形成。 因工程疫苗 基因工程疫苗是指在高效表达系统中表达出来的强毒病原体的某种免疫相关抗原。常用的表达系统为大肠杆菌、酵母和昆虫细胞表达系统 , 这些表达系统能够对病毒的免疫相关抗原进行高效表达 , 但仍存在完全不能或部分糖基化、磷酸化的问题 , 从而不能真实的表达免疫相关抗原蛋白。如黄亚东 (2003), 廖明 (1997)分别在毕赤酵 母和昆虫细胞中表达了 1基因 , 所表达蛋白的分子量小于天然蛋白。尽管这些表达系统存在一定的缺陷 , 且 1基因中和位点的高度构象依赖性一定程度上妨碍了 但有资料表明单独使用传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗免疫仍可产生一定的保护免疫效应。 等( 1998)重组杆状病毒表达了 1基因 , 单独用重组的 学位论文 第一章 6 50%, 而用异源弱毒疫苗株 1糖蛋白进行加强免疫 , 对肾的保护率达到 83%, 这些实验数据 表明单独使用重组杆状病毒 酸疫苗 型依赖性复杂抗原位点的免疫反应 , 甚至仅仅表达决定 个 9个寡聚氨基酸的疫苗 , 也能诱发有效的 细胞免疫在 只要克隆新毒株的基因就有可能构建相应的疫苗 , 同时简单的将不同血清型的表达质粒混合或将基因 , 甚至编码血清型特异中和位点或位点的寡聚核苷酸序列克隆于同一质粒 ,就有可能形成新型的多价疫苗。但另一方面免疫接种途径和方式 , 免疫剂量 , 免疫佐剂 , 高免疫原性抗原的选择 , 高效表达载体的构建等因素对 而目前的基因免疫技术不是太成熟 , 导致基因免疫效果并不理想。刘思国等 (2001), 陈洪岩等 (1999)分别将鸡传染性支气管炎病毒 基因构建成真核表达质粒接种 结果显示 40%的鸡可耐过 血清 说明 并使鸡获 得 了一定免疫力 , 但保护作用不及传染性支气管炎病毒油苗 , 分析 认为 , 肌注质粒吸收不佳 , 致使主要免疫原蛋白表达量不高而使免疫保护率不高。为了达到更好的免疫效果 ,设计一个完美的免疫策略是很重要的 , 等 (2003)将阿肯色州 1糖蛋白基因 结果显示 , 18日龄的鸡胚用含 3周后用弱毒苗加强免疫使鸡得到完全保护 , 而单独用 疫后未显示以前所报道的抗体反应 , 但仍然有不同水平的保护效应 , 可能是因为含有特异 细胞 , 脾 不同血清型病毒感染鸡的靶细胞 , 故而对鸡产生了不同水平的保护效应。但免疫病理组化研究结果显示 , 胚内接种或肌注 了诱导局部免疫反应 , 可能有必要把疫苗靶向定位到支气管组织 , 这需要通过 据 含有报告基因的仙台病毒衣壳产生了假病毒样颗粒能靶向到真核细胞中的 靶向传递佐剂能使 可能诱导局

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