第六章-人工模拟酶03.ppt

第六章,人工模拟酶-印迹酶,第一节模拟酶的理论基础和策略模拟酶的概念与理论基础、设计要点模拟酶的分类与制备第二节分子印迹技术分子印迹技术的起源与概况分子印迹技术的原理与特点分子印迹聚合物合成材料与制备方法分子印迹技术的应用分子印迹技术存在问题与展望第三节生物分子印迹酶,所谓模拟酶就是利用有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分子，可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。,一、模拟酶的概念、基础与设计要点,第一节模拟酶的理论基础和策略,模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征、酶作用的机理和立体化学等特征的一门科学。分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。,人工酶是指人工合成的蛋白质或多肽类的非天然催化剂。1977年，报道合成氨基酸序列Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe多肽具有溶菌酶的活性，活力为天然酶的50%。1990年，用计算机模拟胰凝乳蛋白酶的活性位点，以酪氨酸为模板，构建出73个氨基酸组成的多肽，活性位点由HisAspSer组成。对烷基酯底物的活力为天然凝乳酶的1%，显示出底物特异性和对抑制剂的敏感性。,酶的模拟工作可分为3个层次：(1)合成有类似酶活性的简单络合物；(2)酶活性中心模拟；(3)整体模拟，即包括微环境在内的整个酶活性部位的化学模拟。目前模拟酶的工作主要集中在第二层次。E.G.可以通过对某些天然或人工合成的化合物引入某些活性基团，使其具有酶的行为。构建模拟酶的酶模型分子：环糊精、穴醚、卟林等。,酶的作用机制：过渡态理论人工系统研究对简化的人工体系中识别、结合和催化3主客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。配位键或其他次级键连接。4超分子化学：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成具有稳定结构和性质的实体，形成“超分子”。功能：分子识别、催化、选择性输出,模拟酶的理论基础,设计要点,设计前：了解酶的结构和酶学性质酶活性中心-底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合方式与能力反应的动力学及各中间物的知识设计中：为底物提供良好的微环境催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性,二、模拟酶的分类和制备,1.根据Kirby分类法单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成。单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。2.按照模拟酶的属性主-客体酶模型、胶束酶模型、肽酶、抗体酶、分子印迹酶模型、半合成酶,胶束酶模型,Cyclodextrin模型,CD分子的修饰：在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能目前：桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用。,A:将电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD第二面，催化叔丁基苯基乙酸酯的水解。B:将咪唑基与环糊精相结合。咪唑在N上直接与-CD的3相连，催化硝基苯醋酸酯（p-NPAc）水解。C:通过修饰底物增加底物与CD结合,从而增加与过渡态的结合。如设计二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基苯酯，催化酯水解加速105-106倍。,第二节分子印迹技术,人们研究分子印迹技术的出发点之一是想从合成的聚合物出发，构建人工酶模型。为了产生酶的活性中心模型，需要有一种方法，它能产生和底物相应的形状，特别是被催化的反应过渡互补的空穴。这种技术能诱导功能基团以预先排列方式的进入空穴。,分子印迹技术内容,选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应用抽提法从聚合物中除掉印迹分子分子印迹技术可以产生与底物特异性结合部位，并将催化官能团以确定的排列引入结合部位，从而制备出催化活性聚合物。,一、分子印迹技术的起源与概况,1、分子印迹技术也叫分子膜板技术，最初出现于20世纪40年代的免疫学，当时Pauling首次提出抗体形成学说。要点：抗体在形成时其三维结构尽可能地同抗原形成多重作用位点，抗原作为一种模板就会“铸造”在抗体的结合部位。后来被“克隆选择”理论否定了，但为分子印迹奠定了基础。生物分子的天然识别模拟产生浓厚的兴趣。,2、1972年WulffG研究小组首次成功制备出分子印迹聚合物（molecularinprintedpolymers，MIPs）使这方面的研究产生了突破性进展。研究主要集中在共价型模板聚合物上，动力学过程较慢，其应用仅限于催化领域，而在分子识别领域的应用没有展开。,3、80年代，非共价型膜板聚合物的出现，1993年Mosbach等人研究有关茶碱分子印迹聚合物，使这一技术有了新的发展，并由此使其成为化学和生物交叉的新兴领域之一。目前，全世界至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国在内的10多个国家、100个以上的学术机构和企事业单位在从事这一技术的研究与开发。模拟生物分子的分子识别和功能是当今最富挑战的课题。,分子印迹技术的原理当模板分子（印迹分子）与带有官能团的单体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来，当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板分子在空间上互补的具有多重作用位点的结合部位，这样的结合部位对模板分子可产生相互作用，因而对以此模板分子具有特异的结合能力。,二、分子印迹技术的原理与特点,分子印迹：是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，这个化合物叫印迹分子。生物印迹类似于分子印迹，主体分子为生物分子。生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消了，其构象被固定了，因而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化在移入无水有机相中才能得以保持。生物印迹（bioprinting）是以天然生物材料如蛋白质、糖为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。蛋白质分子有丰富的氨基酸残基，它们与印迹分子能产生很好的识别作用，可用于制备生物印迹酶。,（一）定义：,原理步骤：,分子印迹技术（MIT）是指为获得在空间、结构和结合位点上与某一分子（印迹分子）完全匹配的聚合物的实验制备技术。,（1）在一定溶剂中，膜板分子（TemplateMolecular，即印迹分子）与功能单体（FunctionalMonomer）依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物-两者的互补反应,（2）加入交联剂（Crosslinker），通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在膜板分子周围形成高交联的刚性聚合物。-聚合反应,（3）将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的功能基团。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统。,分子印迹聚合物原理图,-功能单体,分子印迹技术的特点,（1）预定性（predetermination）即它可以根据不同的目的制备不同的MIPs，以满足不同的需要。（2）识别性（recognition）即MIPs是按照膜板分子定做的，可专一地识别印迹分子（3）实用性（practicibility）即它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体等相比拟。但由于它是由化学合成方法所制备的，因此又具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。,（二）分子印迹发展的基本趋向：,（1）预组装方式：印迹分子先共价结合到功能单体上，然后聚合，聚合后再打开共价键去除印迹分子。印迹分子与功能单体以可逆的共价键结合，如硼酸酯、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯等，所采用的单体通常是低分子的化合物，此单体与印迹分子形成的共价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合后又能完全脱除。特点：空间位置固定准确，能够移走大量的印迹分子。但是，对携带适当结合基团的化合物选择性低。,（2）自组装方式：印迹分子与功能单体之间预先自组织排列，以非共价键如氢键作用、静电作用、-作用、疏水作用、金属-配体作用、电荷转移、范德华力等超分子作用形成多点相互作用，聚合后这种作用保存下来。非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常用的方法。由于非共价键法使用超分子作用制备仿生模型，其分子识别机理类似于天然生物分子，因此是分子印迹技术的研究热点，发展很快。特点：非共价法的分子印迹系统具有多样性和普遍性,可使用多种功能单体,印迹分子可以用很简单的方法除去,但专一性不如共价结合作用.,（3）将共价作用与非共价作用相结合，应用于制备分子印迹聚合物（MIPs）在制备MIPs及其后续过程中，一般来讲，使用单一的作用方式制得的MIPs的选择性较低，因此大多使用多种作用相互结合来制备具有高选择性和分离能力的MIPs。,三、分子印迹聚合物合成材料与制备方法,1、膜板分子的选择聚合物几乎对膜板分子没有限制，碳水化合物、羧酸类、氨基酸、乃至金属离子均可被用于制备MIPs。一般地，分子中含有强极性基团的化合物易于制备高效能的MIPs，选用能与功能单体间形成氢键的化合物。,（一）材料的选择,2、溶剂的选择溶剂对印迹分子不但应具有较高的溶解度，最好还能促进印迹分子与功能单体间的相互作用，至少不干扰这种作用。所以必须根据印迹分子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜的溶剂。极性溶剂会将低印迹分子与功能单体的结合，干扰氢键的形成，生成的MIPs选择性差。选择：笨、甲苯、氯仿、二氯甲烷等。丙酮、乙醇、甲醇等。溶剂起致孔剂的作用。,3、功能单体的选择制备共价键型印迹聚合物通常使用的功能单体是含有乙烯基的硼酸、醛以及二醇等。因为硼酸和邻二醇基团形成的脂键可逆性好，易于形成和断裂。非共价型印迹聚合物最常用的功能单体是-甲基丙烯酸,其分子内除具有一个碳碳双键外,还具有一个羧基,可以以离子键与胺、羧基化合物等发生作用，也可以以氢键与酰胺、氨基甲酸酯和羧基化合物发生作用。另外采用天然分子如蛋白质制备MIPs称蛋白质印迹技术（molecularimprintingofproteins）,4、交联剂的选择制备MIPs目前最常用的交联剂是乙二醇二甲基丙烯脂(EDMA),主要是因为其价格便宜,容易纯化,而且制备的分子印迹聚合物性质稳定。除此之外，N，N-亚甲基二丙烯酸胺、3，5-二丙烯酰胺基苯甲酸、二乙烯苯、等也是常用的交联剂。,（二）MIPs制备的链引发方式和聚合方法,1.链引发方式MIPs制备过程中的聚合反应是通过自由基引发的，一般以偶氮二异丁腈（AIBN）或偶氮二异庚腈为引发剂。常用的引发方式有光照、加热、加压、电合成等。低温光引发应用最为普遍，其中又以紫外光的能量适中而应用最多。热引发也较为常见，但此法对热不稳定的化合物不适用。,2.聚合方法聚合的方法有原位聚合、悬浮聚合、表面印迹、膜制备技术以及封管聚合等多种。（1）原位聚合法:原位聚合采用印迹分子,功能单体,交联剂及致孔剂在柱内直接聚合成整体柱，这是较简便的方法。（2）悬浮聚合法：Matsui将印迹分子及单体溶于氯仿,加入有聚乙烯醇的水溶液,用悬浮聚合的方法合成了球形印迹聚合物。,（3）表面印迹法：Prasad用对氨基苯甲酸,二氯乙烷,和硅胶反应,在印记分子存在的条件下,合成了硅胶表面键合印记固定相,用于进行药物及血液样品的净化及-内酰氨抗生素的富集。无机物为载体的表面印迹固体材料的表面修饰蛋白质的表面印迹,（4）封管聚合法：将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定的比例溶解在惰性溶剂中,然后移入一玻璃安培瓶中,采用超声波脱气,通氮除氧,在真空下密封安培瓶,经热引发或紫外光照射引发聚合一段时间得到块状聚合物。经粉碎、研磨、筛选等过程获得适度大小的粒子,洗脱除去膜板分子,经真空干燥后即成。该方法制备的MIPs具有满意的“记忆能力”,对印迹分子有良好的选择性和识别性，合成条件易于控制，但聚合物粒子均匀度差，制备率较低。,分子印迹聚合物的性能测定,电势测定法高效液相色谱分析傅式变换红外光谱法核磁共振法,（三）分子印迹聚合物的特性,评价指标特性物理稳定性抗机械作用、高温、高压化学稳定性抗酸碱、有机溶剂、金属离子储存时间8个月(吸附性能不变)吸附容量印记分子/聚合物=0.11mg/g对印记分子可重复使用100次以上且不丢失的记忆性吸附性能回收率99%结合强度mm级(色谱),nm级(放射性配体分析),四、分子印迹技术的应用,（1）用于化学仿生传感器（2）膜技术（3）天然抗体模拟（4）选择性催化剂（5）用于色谱固定相（6）固相萃取剂（7）药物手性分离（8）药物控制释放（9）农残分析,化学仿生传感器,化学或生物传感器是由分子识别元件和信号转换器（如电极、光极、场效应晶体管、压电晶体、热敏电阻等）所组成。近来，生物传感器技术的发展极为迅速。但是，用于生物传感器的生物分子却因为性能不稳定易被破坏，且种类太少而不能满足实际应用的需要。由于分子印迹聚合物具有可设计性，种类极其丰富，且坚固耐用，有很强的抗酸、碱能力，环境适应性很强，故科学家们设法用MIPS来替代生物分子以适应生物传感器技术发展的要求。,自分子印迹技术用于膜传感器以来，MIPs在生物传感器上的应用就一直是研究热点，尤其是近两年来，该技术发展极为迅速，Malitesta,Haupt,Yano,Ansel等人在这一方面都作了广泛的研究。98年在波士顿召开的有关化学传感器的国际性会议,对分子印迹技术在生物传感器中的应用的现状和未来作了全面而系统的探讨，为分子印迹技术和传感器技术的发展开辟了新的道路。将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件，然后通过各种电、热、光、质等手段转换成可测信号，可定量分析各种小分子有机化合物。,膜技术选择性运输和分离中性分子的模板聚合物膜的制备技术。仿生膜的稳定性和机械强度明显优于生物膜。天然抗体模拟MIPs模拟天然抗体具有很大的优越性。不需实验动物和免疫技术，可耐酸、碱、高温、高压环境及有机溶剂，且可回收多次利用。Mosbach等用MIPs代替抗体在RIA测定中检测药物中的吗啡、茶碱等，取得了与单抗相似的交叉反应。,选择性催化剂因为分子印迹聚合物内的孔穴类似于酶活性中心，因此具有模拟酶催化作用。通过选用适当的模板和功能单体在孔穴内可以定制出与底物结合的结合位点和起催化作用的活性基团，这些基团以最佳取向在空间进行确定排列。模板聚合物作催化剂时，许多情况下与用酶作催化剂相似，符合米氏方程动力学。,用于色谱固定相MIPs最广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离混合物。无论是小分子（氨基酸、药品和碳氢化合物），还是大分子（如蛋白质），都已经被用于各种印迹技术中，并用于HPLC、TLC和CE分离中。分子印迹聚合物作为色谱固定相广泛应用于拆分外消旋体。此外在非手性分子的识别分离方面也有了新的进展。,药物手性分离随着药物研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的有效成分往往具有不同的手性性质，尽管分子式相同，但其药效不同，甚至相反。结构相似的化合物的分离，尤其是药物的手性拆分是当前分子印迹技术研究中最为活跃的部分，因为拆分合成药物一直是制药工业中的一大难题。目前MIPs应用最多的领域是亲和分离。分子印迹聚合物能够识别分子结构上极其细微的差别，在分离异构体上有其独到之处，可用于除去含量很少的对映体异构物，且具有可设计性，适用范围广，成为最有前途的分离手段。,E.g.南开大学何锡文等利用分子印迹法对药物扑热息痛、头孢氨苄、氟哌酸等分子印迹聚合物的合成和结合选择性进行了报道；有人研究利用分子印迹技术对麻黄碱、水杨酸、氧氟沙星等药物的分离效果作了系列研究，取得了较大进展。,药物控制释放印迹高聚物可以吸收大量与印迹分子结构相似的物质,可以被用来作为一种反应性控制释放载体。研究者提出了药物控制释放机理,以某种印迹分子为模板制得的印迹高聚物载着一定量的与该种印迹分子结构相似的药物分子,这种聚合物在该印迹分子存在的溶液中可以加速药物分子的释放。可以想象,这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后,如果人体内存有该种印迹分子,则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附,从而导致药物分子的逐步释放。当然，该高聚物应是可体内降解的。,在生物样品分析上的应用:生物样品中某种成分的测定在疾病诊断,药物动力学分析,法医学,动物食品检验等领域得到广泛的应用。在生物样品分析中,许多内源性的物质的存在使得样品的净化成为不可缺少步骤。而分子印记固相提取显示了巨大的优越性。Sellergren采用分子印记固定相选择性地富集尿样中的喷他脒,用pH为9的流动相除去尿样中的碱性化合物,然后以pH为3的流动相洗脱待测物,直接进行紫外定量检测.,痕量物质的富集,人们早就认识到，模板分子难以100%的从MIPs上洗脱掉，一般总留有少量的残余物(约5%)。过去，人们认为这些残余物深陷于聚合物网络之中而无法去除，但最近的一些研究工作表明事实并非如此，这些经多次反复洗脱而没有除去的模板分子会慢慢地从MIPs上“泄漏”掉.利用这一性质，将MIPS用作固相萃取剂去富集低浓度的分析物质会起到惊人的效果。Anderson等采用这一方法富集人体血浆中的Sameridine药物达到了很好的效果。在分析研究中，毫摩尔水平以下的痕量物质，经这一方法预富集处理后，便可以在气相色谱上很容易地检测出来.,分子印迹固相提取在环境样品分析中应用,一些极性强的农药在疏水性的C18键合固定相上不能与极性干扰物分离,此时分子印记固定相就能够将干扰物与待测物分开。科研工作者使用五羟黄酮印迹聚合物提取银杏叶中药用黄酮,在仔细选择净化剂后,干扰剂可以被除去,提供了提取银杏叶中药用黄酮的可能性,五、分子印迹技术存在的问题,首先，分子印迹过程和分子识别过程的机理和表征问题、结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质机理仍然是研究者们所关注的问题。如何从分子水平上更好的理解分子印迹过程和识别过程？第二，目前使用的功能单体、交联剂、和聚合方法都有较大的局限性。功能单体种类太少，不能满足某些分子识别的要求，因此分子印迹技术远远不能满足实际应用需求。,第三，目前分子印迹聚合物大多只能在有机相中进行聚合和应用，而天然的分子识