【毕业学位论文】（Word原稿）水稻大规模增强子捕获系群体的创建与初步分析生物化学与分子生物学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 硕士学位论文 水稻大规模增强子捕获系群体的创建与 初步分析 目录 摘要 . I . 一章 文献综述 . 1 稻基因组研究概述 . 1 签技术及其在植物功能基因组研究中的应用 . 2 移和整合的机理 . 3 入标签研究基因功能的策略 . 5 和突变体库的建立 . 8 入突变在水稻基因功能研究中的应用现状 . 9 杆菌介导的基因转化法 . 10 强子捕获元件插入片段侧翼序列的扩增及分析 . 10 研究的意义和技术路线 . 12 第二章 水稻大规模增强子捕获系群体的创建 . 13 料与方法 . 13 料 . 13 法 . 14 果与分析 . 20 稻胚性愈伤转化及转基因株系的获得 . 20 基因植株的分子检测 . 22 0 代转化苗的种植和种子收获情况 . 23 论 . 23 第三章 水稻大规模增强子捕获系群体的初步分析 . 25 料与方法 . 26 料 . 26 法 . 26 果 . 26 论 . 29 第四章 部分水稻增强子捕获系 . 32 料与方法 . 33 料 . 33 法 . 33 果与分析 . 35 应体系的建立 . 35 翼序列的扩增 . 36 入 位点初步分析 . 36 论 . 37 结论及创新点 . 39 参考文献 . 41 致谢 . 51 I 摘要 水稻 (.)是最重要的粮食作物之一，具有较小的基因组（ 430与其他禾本科植物的基因组具有良好的共线性，易于体外操作与分化，是研究单子叶植物基因组的模式植物。近年来水稻基因组研究取得了很大进展，构建了遗传图谱和物理图谱，完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测序（ Yu et 2002； et 2002） ， 2002 年 12 月 18 日 国际水稻基因组测序 计划工作组在东京宣布，国际水稻基因组测序计划已圆满完成，共测定碱基对 366, 000精确度达到 并预测遗传基因 62, 435 个。 在此基础上，许多实验室开始大规模地、系统地进行水稻基因功能的研究。建立水稻突变体库是功能基因组学研究的有效手段，而高效的水稻转化体系是建立突变体库的重要基础。本研究正是在建立起了高效水稻农杆菌转化体系基础上，构建了一个大规模的水稻增强子捕获群体，并对其进行了分子鉴定，初步建立起适合该群体的扩增 翼序列的 术体 系，已扩增了部分突变体基因组中的 翼序列，并对部分侧翼序列进行了测序分析。 本研究是国家“ 863”计划项目“水稻突变体库的建立”的一部分，在这两年的研究中，在与实验室全体人员的共同努力下，取得了以下几个方面的进展： 1. 在农杆菌 (导的水稻转化中，发现共培养后的愈伤组织在选择培养基上的继代培养的时机对抗性愈伤组织产生和正常生长有很大的影响，最佳的时机是在选择培养 1015天后进行继代培养，这样 90%以上的愈伤组织可以产生能健康生长的抗性愈伤组织；发现抗性愈伤组织在选择培养基 上的继代培养时间对后边的分化效率有至关重要的影响，抗性愈伤组织继代培养 412 天可以有比较高的分化率，超过 16 天或少于 2 天，分化率急剧降低。抗性愈伤组织在选择培养基上培养 8 天时，分化率最高，达到 85%；在胚性愈伤的诱导、共培养侵染菌液的最佳浓度的确定、共培养的时间以及转化不同阶段的最适培养基类型等方面的研究分析基础上，优化建立起一套高效、操作性强、适合水稻粳稻品种日本晴 (O. 农杆菌转化方法体系。从愈伤组织诱导到得到水稻转化体只需 左右的时间。 2. 选用增强子捕 获质粒（ 粳稻日本晴为实验材料，利用农杆菌介导的方法，获得了 65,707 个增强子捕获 入标签系。经 明 95%以上的转化体含有 入片段。对 植株进行了 交分析， 入片段的单拷贝的植株约占 43%，平均拷贝数为 3. 对 11,560 株 水稻转化植株抽穗期的叶和未成熟种子进行了 织化学染色， 因在抽穗期种子部位和叶部的总表达率为 在叶部的表达率为 在胚的不同部位表达率为 在种皮的表达率为 在胚乳的表达率为 筛选出 210 个在这一生育期表达活性很强的增强子捕获系，取样并提取了 做进一步的研究。 4. 用 增了 328 个筛选出的突变体基因组的 翼序列，对其中 82 个序列进行了测序，作了初步分析。初步建立起突变体插入序列侧翼序列信息的获得、分析等方法体系，已获得一些有价值的 入位点信息。 关键词 ： 水稻，增强子捕获， 性组织化学测定，侧翼序列， is of It is a of of 430 of as 8, 2002 66,000 NA 3,435 of in on of is an In a a to we is “863 of of as 1. In we of on on of 0as 0% We on of of on of if is 6 or As an of 5% if on We up of of . on of of of of of at It .5 of to of 2. 65,707 by O. as It is 5% CR In 0 3% is .2 3. US on 1,560 T0 at US in in of in in 210 at NA 4. 28 82 of of of of US 国农业科学院研究生院硕士学位论文 文献综述 1 第一章 文献综述 水稻 (.)，是人类 50%以上人口的主食，目前，世界上水稻年种植面积 生产量 6 亿吨。因为与别的禾本科作物相比，水稻的基因组 (约 430对较小，但基因组具有良好的共线性 ( 和 和 , 1998) ，进化上的关系密切 ；另外， 水稻具有高密度的遗传和物理图谱，两个亚种 . . 全基因组草图已公布（ Yu et 2002; et 2002） ，而且水稻的遗传转化技术体系也比较成熟，所以水稻已成为研究单子叶植物基因组的模式植物。 随着水稻基因组的测序计划的完成， 大量基因组序列和 料的积累，水稻基因的研究进 入到后基因时代。 功能基因组学是后基因时代的重点研究内容，主要研究生物有机体内各基因的功能，进而了解所有基因如何协调发挥作用完成一系列的生长发育过程。通过已知序列的 同源性比较可以预测许多未知基因的功能，也可以通过基因在染色体上的位置进行功能预测。然而，要精确了解每个基因的功能及基因间的互作功能，必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面 (. et 2002)。随着新技术新方法的不断创新开发，分析鉴定基因功能的方法越来越多，并逐渐形成功能基因组学的分支学科，如比较基因组 学（ 转录基因组学（ 蛋白质组学（ 代谢基因组学（ 表型基因组学（ 。但分离鉴定基因最直接有效的方法是构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因功能，因此突变群体的构建是功能基因组学的基础 ( & , 2001; et 2002)。 水稻突变群体的构建方法有很多，如自发突变体的收集及利用、人工突变、化学诱 变、插入突变、基于基因沉默的突变群体的构建等（江树业， 2003）。其中， 入能破坏插入基因的功能，这种功能缺失突变体的表型、生化特征的变化可以为该基因的研究提供有用的线索。变体在过去的研究中已经证明是一种有效的手段（ et 2000; et 1997; et 1990） 。 稻基因组研究概述 最近十年以来，拟南芥 (水稻 (全长 et 2002； et 2003) ，全基因组序列 (2000； et 2002； et 2002； 2003) ，以及表达序列标签 (测定及分析 (et 2003；et 1999； Wu et 2002) 等工作进展迅速，积累了丰富的数据资料。研究人员已经可以利用这些序列信息来揭示大量基因 的功能。各种类型的突变体为基因功能分析提供了极大的便利，基因敲除和无效突变体尤其有价值。 作为模式材料，水稻 (.)具有很多优点：首先，水稻已经有 9000 多年的种植历史，是人类 50%以上人口的主食 (1994)；其次，水稻的基因组与别的禾本科作物相比相对较小，仅 430 1991)，如高粱为 750米为 2500麦为 5,000国农业科学院研究生院硕士学位论文 文献综述 2 小麦为 15,000外，分子生物学研究的基础很好，积累了大量的背景资料 (1995； et 1998； et 2000； et 2000； et 2000) ；已经构建了精细的物理图谱 (et 1997； 1997； et 2001； et 2001；et 2002； et 2002) ；遗传转化方法也较为成熟 ( 2000)。水稻与小麦 (玉米 (大麦 (黑麦 (高粱 (禾本科作物的基因组具有良好的共线性关系，因此水稻基因组结构和功能分析的方法、技术和结果对这些作物的相关研究有重要的借鉴作用 (1999； et 2001； 2002； 2002； et 2002； et 2003; et 2004)。近年来的研究表明，水稻和拟南芥基因组之间的同源性关系十分有限，拟南芥中得到的研究结果往往不能说明水稻和其它单子叶植物中的情况 (et 1998； et 1999; et 2002； et 2002) ，因此水稻基因组研究有着不可替代的意义。 水稻结构基因组学的研究成果为功能基因组学研究打下了坚实的基础。两个亚种 (. . 全基因组草图已公布（ et 2002； et 2002）。 2002 年 12 月 18 日 国际水稻基因组测序 计划工作组在东京宣布，国际水稻基因组测序计划第二阶段的工作已圆满完成，共测定碱基对 366,000确度达到 并预测遗传基因62,435 个 ()； 测序分析结果表明， 98%的玉米、小麦和大麦的已知蛋白可以在水稻基因组中找到编码其同源物的基因 (et 2002)。 分离并测定了 28， 469 个水稻全长 隆的序列；通过在公共数据库中进行同源性查找，推测了其中 21,596 个 编码的蛋白及其功能，发现有些蛋白在水稻中存在，而在拟南芥中不存在； 64%的 拟南芥是同源的 (et 2003)。 另外， 45,000 个水稻 列已测序并于 2001 年释放到公用互联网数据库，但其中只有 25%的序列与已知功能的基因序列同源，大部分的基因序列功能有待鉴定 ( 2001)。弄清这些未知基因的功能将是序列测定完成后的下一步中心任务。功能基因组学的分析工作以高通量为特征，运用一系列新发展起来的研究技术。这些新技术以已知方法为基础，经改进后适用于大规模的基因分析 (et 2002)，如基因芯片技术 ( 2002)， 涉技术( 2002)，靶基因同源重组技术 (et 2002)等。基因组规模的插入突变战略为水稻功能基因组学的研究提供了一个高通量的系统，近年来水稻基因标签技术在原理和方法上都取得很大进展，使得大量快速获得突变标签植株成为可能 ( 2001)。 签技术及其在植物功能基因组研究中的应用 签技术是以农杆菌 (导的转化为基础的一种插入突变研究方法。插入突变是 移并整合到植物基因组中后，相应位点 的基因的表达就可能受到抑制，由于列已知，就象在插入位点处贴了一个标签，使得植物基因组的插入位点很容易辨认。根据插入位点的基因序列与植物表型变异的相互关系鉴定基因功能。除 签技术外还有转座子及逆转座子标签技术等 (et 2000； et 2001)。由于农杆菌介导的水稻转化技术非常成熟，所以 签技术是创造插入突变体的有效途径 (et 1994； et 2001)。利用质粒挽救的方法可以扩增插入位 点的侧翼序列 ( 1992； 国农业科学院研究生院硕士学位论文 文献综述 3 1998)，也可以利用 技术扩增 翼序列。若插入的是无启动子的 报告基因，则一旦 入植物启动子附近，就可导致报告基因的表达，从而可以在细胞或组织水平上对启动子进行筛选（ 2001）。 由于 插入通常是稳定的，而且主要是以单拷贝的形式插入，大大降低了基因沉默的频率，且插入不具有基因位点特异性，可以建立饱和的 入突 变库 ( 2002)。所以随着农杆菌 (导的水稻转基因技术的不断完善， 入技术已成为快速构建插入突变体库的主要手段 (et 1999; 1997)。 移和整合的机理 自根癌农杆菌 (根癌农杆菌是植物冠缨病 (病原菌，其菌体内有一个能使植物产生肿瘤的质粒 (粒， 粒上含有一段 以转移到寄主的染色体内，此即为 叫转移 i 质粒 长度的 10%左右，在病原菌致病过程中，它能随机且稳定地整合到植物基因组中，并能稳定表达。 有植物激素基因及产生特殊衍生物（ 基因，这一段基因插入寄主染色体后，即可使寄主细胞大量增生并产生特殊氨基酸衍生物供菌体利用。这种以基因转移的方式迫使寄主产生特殊产物而加以利用的方式，为植物转基因提供了一个非常有用的载体。 1983 年，科学家 们首次利用 粒作载体，将外来基因转移至植物染色体中使其表达，由比利时根特大学的 导的研究组以及由 司 导的研究组，分别将 的致瘤基因切除，代之以外源基因，证明可以将外源基因转入植物基因组，并从转化细胞再生成完整的可育植株，至此第一例转基因植物诞生。与此同时，由华盛顿大学 将细菌的新霉素磷酸转移酶（ I）基因转入植物细胞后，植物细胞可抗卡那霉素 (et 1998)。 自从发现 来，对 移是如何起始的、哪种 白帮助 链进入寄主细胞、 寄主细胞核中是怎么定位的以及 白和植物蛋白在 合中的作用等方面已做了大量的研究，有很多这些方面的报导。 移主要有以下几个过程：农杆菌附着到寄主的细胞壁； 农杆菌中被加工剪切； 过寄主的细胞壁，细胞膜，核膜；合进寄主基因组 (贾士荣， 1994)。 关于 移和整合的机理，迄今尚不完全清楚。已知在 侧是一对保守的， 25且在一系列不同植物的肿瘤 发现， 两边的端点就位于这种同向重复序列的当中或附近，所以说这种重复序列实质上就是 边缘区。这种重复序列同 移到植物细胞并整合到核基因组的过程有关。有证据表明，整合的 端点，是同这种重复序列紧密相连的（ 1986） 。如果缺失突变去掉 粒右边界（ 转移能力就会丧失。将人工合成的同野生型边界序列一样的一段25的寡核苷酸序 列，克隆到原先已缺失的 置上， 之也恢复了致毒力和转移能力。不过这种恢复也有条件，即合成序列克隆的方向必须与野生型的完全一致（ 1986） 。在同植物原生质体共培养的根癌农杆菌细胞中， 在 25向重复序列处发生删除和环化的，而且这种环状的 其从细菌细胞向植物细胞转移的一种中间中国农业科学院研究生院硕士学位论文 文献综述 4 形式，由此说明 边界区在 粒的转移过程中起着重要的作用。 转移与整合需要 粒上 30 编码的基因。这个区段是由至少 6 个 基本操纵子 ( 两个非基本操纵子 (成的。每个操纵子上的基因数目不同。 有一个基因， 含 2 个基因，而 别包含 4 个和 11 个基因。只有 组合型的操纵子，编码一个二元系统（ 激活其它 因的转录活性（ 1986） 。 一种二聚的跨膜信号传导蛋白，检测由植物损伤组织释放的信号分 子，主要是酚类复合物。激活 因子包括酸性 类复合物如乙酰丁香酮 (一些特定种类的单糖。 白在结构上可以定义为 3 个区域：周胞质区域和两个跨膜区域（ 域作为信号传导器和感应器。周胞质区是主要的单糖检测器。在周胞质区域里，接着 域的是一个两亲性螺旋，带有强亲水性区和强疏水性区。这种结构是独特的，别的跨膜感应蛋白和折叠会同时与内膜排列或锚到膜里。 激酶域，在 激活中起决定性的作用。通过一个保守 的组氨酸 基上的自身磷酸化应答植物损伤位点的分子信号。 答低水平的酚类复合物。激活的 以把它的磷酸盐转移给细胞质结合蛋白 一个保守的天冬氨酸残基。 功能是在 因被磷酸化时作为调控其表达的转录因子。 C 末端是 合区，而 N 末端是磷酸化区，与 接受区域相同 (et 1990)。除了这些 粒编码的基因之外，还已鉴定出一些位于根癌农杆菌染色体 的基因，编码一些转录因子，调节 因的表达，同样也参与了 移作用（ 1998） 。统的活性也受一些外部因素如温度和 影响。在温度高于 32时， 因由于 叠结构的变化诱导的不活泼而不能表达。温度对 影响能被 一种突变型 (制，激活 因的组成型表达（ 1998） 。 研究已阐明， 因在转录水平上表达，是受植物信号分子，例如烟草的乙酰丁香酮 ( 正调控。这些 信号分子是由植物创伤细胞分泌产生的酚类物质，可以激活 生从细菌到植物细胞的定向转移（ 995）。 因被诱导表达后，合成蛋白形成菌丝， 此转移到植物细胞中。这种菌丝的成分是由 纵子编码的（ 2000）。 白在转移复合体的形成中起重要作用，辨认 界序列，利用内切酶活性切割负链的两端（ 1997）。推测切刻位点是 过刻切后， 然共价附着在单 末端。这种结合阻止核酸外切酶对 5端的攻击，还作为标识使 5端作为 移复合物的前导端。单链 外实验证明 存在是 解超螺旋链底物所必需的。受到信号分子的激活作用之后， 因编码的一种核酸内切酶，先在 右边界序列序列（ 的第 3 和第 4 碱基之间切开一个单链缺口，随后在 一条链的左边界序列（ 切出第二个单链缺口，于是 以单链形式释放出来，并在 列的引导下定向地从农杆菌细胞转移到寄主细胞。这条转移的单 链特称为 的极性转移现象，大概可以解释为什么要发生 子的有效转移，就必须有 列这个实验性的结论。事实上，在没有 列存在的情况下，章鱼碱质粒 列，至少能够引导长达 20相邻国农业科学院研究生院硕士学位论文 文献综述 5 在 列缺失时，这种转移的 段的末端是随机终止的（ et 2002）。 由 因编码的 白质是一种单链 合蛋白，它大概是以共价的方式与经过加工 了的 子的 5保护其免受核酸酶的降解作用，并定向地将此 入植物细胞核内，最终整合到染色体基因组上。由于 白具有两个性质不同的、在植物细胞中具有活性的核定位信号（ 因此对于 子定向导入细胞起着重要作用（ 000）。 入标签研究基因功能的策略 入突变体策略不仅仅限于研究植物的表型变化，还可以探索基因表达模式。如增强子捕捉 (基因捕捉 (报告基因的表达依赖 于插入位点旁侧的转录调控序列。另一种方法是建立融合表达的突变体，如激活标签 (可以得到功能获得性表型（ 1999）。 因敲除 (基因敲除 (零式突变 (一条确定基因产物功能的直接方法，若有感兴趣基因的零式突变体，我们即能直接检测缺失该基因后对有机体功能的影响。几种基因敲除类型见图 在功能基因组学研究中，传统途径是创建 入突变体群体，再利用对突变体筛选 和表型鉴定来鉴别基因，常常是靠基因被破坏后显现的表型来确定基因。这种方法一直很有效，得到许多表型相应基因功能的突变体（ 2001）。但是，这种方法不能有效鉴别功能重叠基因（即所谓的冗余基因）和那些在不同的发育阶段表现不同功能的基因。 在现已研究清楚的遗传性状中，许多是通过功能缺失或基因敲除分析得到的，但是许多基因在功能上是重复的，它们的突变不可能导致易于识别的表型，因为同一或其它基因家族的成员可提供相同的功能，而且许多基因在多个发育阶段有功能，这些基因的突变可导致早期致死，或者可能有多效性 ，它能在一个特定的代谢途径中掩盖某一基因的作用。此外，瞬间表达的基因、表达水平很低的基因、以及在少数细胞中表达的基因，都可能难以被鉴定出来。因此在大多数情况下基因的敲除并不能够产生明显的表型变化 (et 2000)，这给分析基因功能带来了难度。 许多敲除突变体没有可见的表型改变，其可能原因之一是在一个基因家族中的多个成员有功能重复。为测试这种功能重复，可将含同一基因家族不同成员突变的植株相互杂交，产生多个成员突变，即 变。首先创造双突变系，若能存活，则与第三个成员突变的 纯合系杂交，因为每个突变都有 入作为标记，故用 以确定复杂突变背景的基因型。通过这种聚合，理论上应能敲除基因家族中的任何一个成员，使多个基因不在染色体上连锁太紧。一旦有了多个突变系，则就可以将这些株系相互杂交，以获得复杂的分离群体，并可用 定分离群体中具有特征表型的基因型。 因捕获 基因捕获技术为发现新基因提供了新的研究思路。基因捕捉是最近发展起来的方法。这种方法体系是依靠随机整合到基因组的报告基因（如 ）的表达模式来鉴别基因，并不完全依赖于突变体的表 型。这种方法对于鉴别未知基因和调控序列非常有效 (1999; 中国农业科学院研究生院硕士学位论文 文献综述 6 2001)