【毕业学位论文】（Word原稿）枯草芽孢杆菌368核黄素高产原因的遗传分析以及工程菌株的初步构建生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 枯草芽孢杆菌 368核黄素高产原因的遗传分析以及工程菌株的初步构建 of 68 of of 68 of 本研究以 枯草芽孢杆菌 368（核黄素高产菌株）为研究对象，对直接影响其核黄素产量的 3类基因进行了克隆和测序。结果发现：该菌株的核黄素高产原因与 突变可以导致它所编码的黄素激酶活性大幅度下降 ，黄素激酶活性的下降一方面可以降低核黄素在代谢途径中的进一步转化率，增加核黄素的积累；另一方面还可以降低细胞中的 素单核苷酸 )、素腺嘌呤二核苷酸）水平，而 及核黄素转运蛋白 (表达量，从而有利 于核黄素的生成与对外运输，增加该菌株的核黄素产量。另外我们对枯草芽孢杆菌中的核黄素操纵子做了进一步的优化和改造，主要包括：调控序列的去除、外源强启动子 加入、原启动子的去除以及四环素抗性基因的加入等。分析比较了它们在不同大肠杆菌中的游离表达情况， 尝试以大肠杆菌为出发菌株进行核黄素高产工程菌株的构建 。结果表明：去掉 加入一个外源强启动子 黄素合成基因的表达量可以得到明显的提高。当以 100g/的核黄素产量可以达到 86g/床水平）；当加入四环素抗性标记基因并以 20g/四环素为选择压力时其核黄素产量可以达到 108g/床水平），与未经改造的 0 倍。最后本研究对枯草芽孢杆菌的转化方法做了进一步的摸索和优化，用甘氨酸培养结合电转法可以使枯草芽孢杆菌 式菌株）的转化效率达到 104，明显高于其它方法。另外通过构建整合型载体将优化好的 检测分析了外源基因 的整合及表达情况。该研究为进一步构建核黄素高产工程菌株奠定了基础。 关键词： 核黄素，基因工程，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 he In to of to in a in is in of to MN in of of to of In MN AD on a to On of by as a we of of by by 00g/as a of 6g/0g/as an 08g/ml of we a as 104 ,In we an it of of be to 录 中文摘要 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A B S T R A C T I 第一章 绪论 - 1 研究的目的和意义 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 2 目前国内外研究进展 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 黄素的理化性质和生理作用 黄 素的应用 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 黄素的工业化生产 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5 黄素合成的分子生物学研究进展 因工程技术在核黄素生产中的应用 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 前国内外核黄素产业的发展现状 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 11 3 研究 的 内容和方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 13 第二 章 核黄素高产原因分析以及核黄素操纵子的改造 - 1 4 1 材料与方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4 验材料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 要仪器、工具酶与试剂 4 用溶液和缓冲液 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 4 养基 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 验方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 2 结果与分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 19 黄素高产原因的分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 19 黄素操纵子的拼接及改造 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 23 3 本章小结 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31 三章 核黄素操纵子在大肠杆菌中的表达 2 1 材料与方法 - 32 1 . 1 实验材料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 32 要仪器 2 剂和溶液 - 2 养基 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 验方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 33 2 结果与分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 35 黄素的定性 分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 35 黄素的定量分析以及 o p e r o n 表达条件的优化 6 肠杆菌核黄素生产能力的分析与比较 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 42 3 本章小结 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 44 第四章 枯草芽孢杆菌转化方法的优化及工程菌株的构建 5 1 材料与方法 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 45 1 . 1 实验材料 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 45 要仪器、工具酶与试剂 - 5 养基和溶液 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 45 验方法 6 2 结果与分析 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 48 种不同转化方法的比较 - 48 化方法 优化 0 合型载体的构建 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 53 枯草芽孢杆菌的转化 3 转化子 进行 测 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 53 黄素产量的检测 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 56 3 本章小结 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 56 结论与讨论 - 57 参考文献 - 1 致谢 5 附录 6 作者简历 - 71 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 1 研究目的和意义 核黄素 是动物体自身不能合成的低分子有机化合物，是维持机体正常代谢所必需的营养物质，在医药、食品以及饲料行业中具有广泛的应用价值。 近年来核黄素产业发展迅速，尤其是微生物发酵法 以其高效、节能 、污染小等特点在核黄素产业中逐步占据主导地位并成为未来的发展趋势。 因此筛选分离不同的核黄素高产菌株，研究其高产机理，并以此为依据进行核黄素高产工程菌株的构建，已成为国内外专家学者研究的热点。本研究以一株核黄素高产枯草芽孢杆菌 368为研究对象，对与核黄素合成直接相关的几类基因进行了克隆测序，从分子生物学水平上分析了其高产机理，为今后构建核黄素高产工程菌株奠定一定的理论基础；另外，对来源于枯草芽孢杆菌 368 中的核黄素操纵子 了不同的优化和改造，研究比较了它们在不同大肠杆菌中的表达情况，尝试以 大肠杆菌为出发菌株进行核黄素高产工程菌株的构建；最后本研究对枯草芽孢杆菌的转化方法做了进一步的摸索和探讨，并以枯草芽孢杆菌为受体菌进行核黄素工程菌株的构建，对构建核黄素高产枯草芽孢杆菌进行了初步的研究和探索。 2 目前国内外研究进展 黄素的理化性质和生理作用 核黄素（ 名维生素 生素 G、或乳黄素，其分子是由一个异咯嗪环和五个碳原子的糖侧链组成。分子式为 子量为 376 。固态核黄素为黄色针状结晶，熔点为 292，味苦。纯核黄素溶于水，更易溶 于碱液、甲醇、乙酸和醋酸中。不溶于丙酮、醚、苯、和三氯甲烷。核黄素的水溶液呈黄绿色，并在紫外光中表现强烈的黄绿荧光，核黄素见光易分解，但在黑暗处和常温下，结晶状或水溶液中的核黄素是稳定的，此外溶液的酸碱度也大大影响其破坏的速度。核黄素在酸性条件下比较稳定，能耐高温，但在碱性条件下则极易破坏；核黄素很易被亚硫酸盐所还原，还原后生成无荧光的无色二氢化合物，但在空气中经反复震荡后仍可重新氧化而形成核黄素，并恢复其特有的颜色和荧光。 核黄素是人体必需的一种水溶性维生素。具有广泛的生理功能，是维持机体正常代谢所必需的 营养物质。它是机体内许多酶系统的重要辅基 黄素腺嘌呤二核苷酸（ 黄素单核苷酸 (组成成分。一分子的核黄素和 的一分子磷酸组合生成黄素单核苷酸 (一分子的 和一分子 的 合形成 特定的蛋白结合则形成具有特定功能的复合物，参与机体的正常代谢。在机体的能量代谢中，以 辅基的黄素蛋白（ 呼吸链的重要成员，参与传递 H 和电子的作用。而机体进行各项生命活动所需的能量大部分来自于电子在呼吸链上进行传递时所形成的 糖代谢、脂肪 代谢以及蛋白代谢过程中 作为某些氧化还原酶的辅基来维持机体的正常代谢反应。如三羧酸循环中丙酮酸氧化脱羧酶系中的二硫辛酸脱氢酶，其辅基便是 外，脂肪酸氧化过程中的脂酰氢酶、氨基酸氧化脱胺过程中的氨基酸氧化酶等，其辅基也都是 参核酸代中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 谢和机体的抗氧化作用。因此如果机体缺乏核黄素就会影响生物体正常的氧化作用，引起物质代谢紊乱，出现一系列的病症，严重的将会导致死亡。 核黄素在机体中储存有限，多余的部分随尿液排出体外。在人与动物体内，除肠道细菌能合成少量核黄素外，机体本身 不能合成，需从食物中摄取，因此机体需要经常补充核黄素使核黄素的日摄入量不低于某一数值。间。若长期低于这一范围，人体则会因缺乏核黄素而出现一些典型的病症，如：阴囊炎、皮炎、口角炎、舌炎等。因此核黄素被世界卫生组织列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一。对于动物，每公斤饲料中的核黄素含量应保持在 1 间。家禽或家畜的核黄素摄入量不足会导致动物生长受阻、食物的利用率降低，严重的还会引起腹泻。我国规定膳食中核黄素的供给量为 000我国人群的食物结构中维生素 量偏低。一般 100生素 们从膳食中摄入的维生素 量仅为正常需要量的 55%。因此在日常食品中添加适量的核黄素将有助于改善我国人民的核黄素营养状况（ 陆海鹏 黄素的应用 由于核黄素除具有上述广泛生理功能，因此作为生物体所必不可少的一种营养物质，在医疗保健、食品工业、饲料工业、以及化装品工业 中均有重要的价值。 黄素在医疗保健方面的应用 核黄素早年主要用于防治核黄素缺乏病 ,如舌炎、口角炎、阴囊炎等，近年来的研究表明 ,核黄素还有利尿、防癌、降血脂和改善心功能等作用，它的重要性已引起广泛的关注 (王林静， 2000)。 黄素与生长发育 目前在多种动物中已进行了核黄素缺乏的研究 ,核黄素缺乏可产生一些重要的影响 ,其中最主要的是生长障碍。杨焕民等人以 1日龄大鼠作实验时也发现 ,低温下补充适量核黄素有利于生长激素和胰岛素的分泌 ,从而有利于生长；且通过增加肾上腺皮质束状带宽度及 束状带和髓质细胞数 ,降低血清中的 促进机体冷适应 ,提高机体耐寒力。因此耐寒环境下适量补加核黄素有利于动物的生长 (杨焕民， 1998)。人体研究也得出相应的结论：孕期核黄素摄入量与新生儿出生体重呈正相关而且强化核黄素的食品能有效地改善小学生营养状况和促进其生长发育（ 莫静贤， 1996）。 黄素与生殖 核黄素对维持哺乳动物正常生殖功能起重要作用。凌诚德等指出核黄素对“敌枯双”染毒后的孕鼠有阻抑致畸作用，核黄素吸收正常的实验组其脑畸形率明显低于对照组，而其活胎率、着床率则明显高于 对照组（ 993）。 黄素与缺铁性贫血 我国人群中，核黄素缺乏及缺铁性贫血的发生率均较高，尤见于儿童、孕妇。因此 ,铁、核黄素与缺铁性贫血关系的研究是近年来国内外学者重视的研究课题。国内外大量的动物实验表明，核黄素缺乏组的血红蛋白量及肝铁浓度均明显低于对照组。人群调查也证实 ,核黄素缺乏者的平均血红蛋白量与血清铁蛋白 (度均低于正常者，且其贫血率及缺铁率高于核黄素营养状况正常中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 者。机体核黄素的缺乏 ,可能导致小肠粘膜 化还原酶 (即铁蛋白还原酶 )活力降低 ,该酶可将结合型的铁蛋白中的三价铁还原为游离型的二价铁 ,因此其活性降低 ,将影响肠粘膜中铁蛋白铁的动员 ,如果这一作用机制的解释能进一步得到证实 ,则核黄素缺乏在实际上并不影响铁的吸收 ,而是影响其吸收后粘膜贮存的水平 ,使暂时贮存于铁蛋白中的铁难以动员入血而随肠粘膜上皮脱落重新排出，从而使进入血循环的铁减少，造成一定程度的“空吸收” (陈文根 ,1990)。 黄素与癌 大量的流行病学和动物实验资料表明 ,核黄素等微量营养素具有防癌和抗癌作用。据调查发现 :伊朗、中国等地居民因核黄素缺乏或严重摄入不足而导致 慢性食道炎或食管癌的现象普遍存在。林英等研究也证实 :补充核黄素组的食管癌前病人的食管上皮细胞增生转换的好转率和稳定率明显高于安慰剂组。可见核黄素可抑制食管上皮增生或促进其向正常转化。除影响上皮组织完整性外 ,核黄素还有抗突变作用 ,经 验检测 ,核黄素是黄曲霉毒素 变剂的很有效的拮抗物(林英 ,1995)；周纯先指出 :小鼠腹腔注射核黄素 0时 ,可显著降低 小鼠微核作用 ; 随后李建端等以大鼠作实验时发现 ,在 养基中添加核黄素 (26 130 )可显著抑制甲基苄基亚硝胺 (的致细胞突变作用 (周纯先 ,1995)。 黄素与心血管疾病 近年来 ,核黄素在心血管疾病防治中的作用已日益引起人们的关注。有研究显示 ,核黄素有降血脂、抗血小板聚集、抑制脂质过氧化等作用 ,这些都是与高血压并发症相关的危险因素。据左保华等报道 :高血压患者口服核黄素 (75mg/d)后 ,与用药前比能显著抑制血小板聚集性、降低血清丙二醛含量和甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量 ,增强超氧化物歧化酶活性。在核黄素对冠心病患者心功能影响的研 究中 ,左保华等也发现 : 冠心病患者连续服用核黄素 (75d)， 30能显著改善心脏收缩和舒张功能 ,每搏输出量明显增加。核黄素改善心脏功能可能是由于 : 核黄素是呼吸链电子传递过程中黄素酶类的辅基 ,该酶系参与糖的有氧代谢 ,促进丙酮酸转化为乙酰辅酶 A ,改善心肌能量供应 ,促使缺血性心肌细胞恢复；核黄素有抗血小板聚集作用，阻断因果循环（因血小板聚集增加 ,加重血管内皮损伤及心肌缺血，血管内皮损伤又促进血小板聚集）；核黄素可能通过提高超氧化物歧化酶活性和还原至谷胱甘肽再生发挥抗脂质过氧化作用。核黄素能 减慢和稳定心率、降低心率失常、有助于抗氧反常损伤 (987)。 黄素在饲料工业中的应用 有关核黄素在机体代谢和生长中的作用及其缺乏引起各种症状得到了动物学家的重视并得以开展研究。大量研究表明，核黄素能够促进动物生长，提高动物整体及脑功能，还可以提高动物的生产能力及耐寒能力。因此，在动物饲料工业中核黄素作为添加剂，有广泛的应用前景。 高饲料转化率促进动物生长 顾景范研究发现：一组大鼠自缺乏核黄素第 3日起体重就不再增长，以后 5周均维持在原体重（只增加 10 ；后补充核黄素时，体重立即增加。徐京选初断乳 2个水平蛋白质 (酪蛋白 12和 20 )、淀粉 (30和 65 ) 、核黄素（ 12g/4g/d）组成 2 2 2析因实验，研究大鼠核黄素营养状况及需要量与膳食因素的关系。结果表明，核黄素需要与膳食中蛋白质和淀粉摄中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 入量有关，高蛋白、低淀粉组动物，核黄素需要量相对较高。在同一核黄素摄入水平下，增加蛋白质摄入量，动物生长并未相应改善。而且，核黄素与蛋白质之间存在着一定数量关系，两者比值在动物生长中起着关键性作用，蛋白质的量决定了核黄素的最低需要量，当 摄入量低于这个最低需要量时，就不能使动物得到最佳生长 (杜留云 ,2002)。 高动物繁殖能力 妊娠母猪的繁殖性能与维生素营养关系密切。董志岩对妊娠母猪的喂养实验中发现，维生素要是提高早期胚胎存活率，改善母猪的繁殖性能。在现时规模化养猪多应激因素的条件下 ,参照 加安全剂量，有利于确保母猪繁殖潜力的表现（董志岩 ,2000）。 高种蛋受精率和孵化率 种蛋中核黄素含量较低，胚胎常常在孵化第 4和 20天因循环系统发育障碍而死 亡。新孵出的雏鸡因胚胎蛋白质代谢不完全导致羽小枝的倒沟不能打开而出现所谓的“棒状绒毛”这提示种鸡日粮中临界缺乏核黄素 (庞昕 ,2000)。 高蛋鸡的产蛋性能和蛋品质 陈艳珍等通过研究发现日粮中添加核黄素显著提高了蛋鸡的产蛋率，降低了料蛋比和死亡率，增加了采食量，蛋重、破蛋率无明显变化。这可能是由于核黄素有利于鸡体内的能量和蛋白质代谢，促进了机体对营养物质的消化、吸收和利用，缓解了应激对蛋鸡产生的不利影响，使蛋鸡生产性能得到了充分发挥。由此可见，在生产中适量补充核黄素是十分必要的，尤其是对集约化、高密度的鸡场更为重要。另外核黄素对鸡蛋品质也有重要的影响，试验结果表明，蛋鸡日粮中添加核黄素显著改善了蛋形指数，使鸡蛋接近标准蛋形，蛋黄比重、蛋黄指数、哈夫单位明显增加，蛋黄颜色加深，对其余指标无明显影响。这说明核黄素能显著改善蛋品质，有利于蛋的储藏、运输和加工，增强了感观效果，能够满足消费者心理要求 (陈艳珍 ,2004)。 进机体冷适应增强耐寒力 分泌系统参与动物的冷适应，其中甲状腺激素起重要作用。由于低温下动物能量代谢增强，核黄素又直接参与这一过程，加之，寒冷等物 理因素，可引起蛋白质和核黄素损失增多，认为低温下动物对核黄素的需要量增加。有数据表明，寒冷条件下补充一定量的核黄素，可以促进机体内的氧化磷酸化过程，使产热升高， 有利于机体耐寒力的增强。杨焕民等（ 1998）在低温下（ 10 2）饲养的大鼠仔，补充核黄素至 60日龄连续暴露 72果表明，增加核黄素供给量对大鼠的增重、肾上腺组织细胞及某些激素的变化均产生有益影响，而且能增强机体抵抗冷应激的能力。因而在寒冷环境条件下适量补加核黄素将有利于动物的生活，并对低温下饲养的仔鼠增重有明显改善作用 (杜留云 ,2002)。 强机体免疫力 核黄素作为许多酶的辅助因子参与机体代谢，通过影响机体对养分的吸收与利用，从而间接参与免疫细胞增殖、分化和 建海等通过在肉仔鸡基础日粮中分别添加 0、 添加 第一章 绪论 5 组均能刺激法氏囊和脾脏发育，其中，脾脏的相对重量增加明显，分别比对照组增加 各水平核黄素处理组均能刺激外周血液中白细胞和异嗜细胞数量 增加，且随着核黄素水平呈递增趋势 (张建海 ,2003)。 黄素的工业化生产 目前核黄素的生产方法主要有两种：一种为化学合成法，另一种微生物发酵法。化学合成法反应步骤多、工艺长、回收率低、成本高（要用到较贵的起始反应物 能大，远不能满足工业需求。因此化学合成法正逐渐被微生物发酵法所取代 (000)。 微生物发酵法所利用的是可再生能源，废物排放量少，生产成本低，是目前国际上倍受推崇的核黄素生产方法。能够产生核黄素的菌种很多，细菌方面有枯草杆菌（ 棒状杆 菌，节杆菌，乙酸丁梭状杆菌，不动杆菌等。真菌方面有棉病囊霉 (季也蒙假酵母(阿舒假囊酵母 (酿酒酵母 (假丝酵母属 ( (陆海鹏 ,2002)。但是真正有商业价值的菌种却很少。 最初利用生物发酵法进行核黄素商业化生产的是一株梭状芽孢杆菌（ ,其培养液为麦芽汁和乳清。由于当时发酵技术及菌 种选育技术非常落后，因此核黄素产量很低。到了 1940 年该方法得到了进一步的改进，菌种也由原来的梭状芽孢杆菌变为阿舒假囊酵母 (979)。即而又改用棉病囊霉作为生产菌株。然而核黄素产量仍不理想(979)。 1965 年有三家公司（ 始利用微生物发酵法对核黄素进行大规模商业化生产。但好景不长，三年后三家公司都相继停产，其原因是微生物发酵法所产核 黄素的量太低，根本无法与化学合成法竞争(981)。 1974 年微生物发酵法重新被 司所采用。他们利用棉病囊霉作为生产菌株，从中摸索出了许多发酵技术，并通过诱变育种技术获得了许多核黄素高产菌株。从此微生物发酵法获得了长足的发展。当时常用的两个高产突变株为 A. 核黄素产量可达15g/L(989)。由于 遗传稳定性差，人们更倾向于利用 为工业生产用菌株 (972)。 在随后的一段时期内 国际上一些知名公司也开始采用微生物发酵法进行核黄素的生产。 1990德国的 司尝试使用 为生产菌株进行核黄素的商业化生产。经过 6 年的发展，他们最终用微生物发酵法完全取代了化学合成法 (996)。美国的 开发出了一株核黄素高产