【毕业学位论文】（Word原稿）耐热大豆β-淀粉酶的筛选及其cDNA在大肠杆菌中的表达微生物硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 耐热大豆 大肠杆菌中的表达 of . I 摘 要 泛存在于各种高等植物和微生物中，它能够作用于多糖的非还原性末端，顺次切割相隔的 4 糖苷键，生成 糖。耐热淀粉酶在食品及饮料工业中具有很重要的应用价值，因为提高反应温度不仅可以增加淀粉的可溶性，而且可以防止杂菌的生长，这对于降低生产成本是十分有利的。 大豆 围广，热稳定性好的特点。本实验对 184 份 核心种质大豆的酶活力和热稳定性进行了测定。筛选得到的 热稳定性最佳的 6 种酶均具有较宽的作用温度和作用 中 5 种 酶的 半衰期（ 63、 过 5h，表明这些大豆 具工业应用价值。 以筛选得到的大豆总 通过 到大豆济 990的 测序结果表明该序列编码 496个氨基酸。 构建表达载体 在大肠杆菌中将 济 99 组酶的分子量大小为 5030诱导，胞内酶活力可达 性染色证明：大豆的 仅能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的蛋白质，同时还能将其分泌到胞外；酶学性质测定表明：重组酶的最适反应温度为 60，最适 为 原始酶一致；在 63保温 5 小时仍然具有 45以上的初始酶活力，说明该重组 酶具有很好的耐热性。 关键词： 大豆， 耐热 达 It is in in as of of of 84 in We 0% of a 53、 to be to NA an 96 by 0 , be pH a 录 第一章 引 言 . 1 . 1 机理 . 1 . 1 . 2 物来源的 . 3 生物来源的 . 4 . 5 物 . 5 生物细胞的破碎和微生物 . 6 . 6 物 . 6 生物 工程研究 . 6 究目的和意义 . 7 第二章 耐热大豆 . 9 料与方法 . 9 料 . 9 法 . 9 果与分析 . 11 芽糖标准曲线的制定与酶活力计算方法 . 11 心种质大豆 . 11 心种质大豆 . 16 豆 . 17 豆 . 17 大豆 . 18 个大豆品种所含 . 18 个大豆品种所含 . 18 长纬度与酶活 力关系分析 . 19 论 . 19 第三章 耐热大豆 克隆及序列分析 . 21 料与方法 . 21 料 . 21 法 . 22 果与分析 . 26 物的设计方案 . 26 . 26 隆 . 27 豆 . 27 已 知 析 . 31 论 . 31 第四章 大豆 . 33 料与方法 . 33 料 . 33 法 . 33 果与分析 . 37 达载体的构建 . 37 组 . 37 . 39 组酶活力及温度对产酶活力的影响 . 40 组酶的酶学性质 . 40 论 . 41 结 论 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 49 作者简介 . 50 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，广泛存在于动植物和微生物中。它最早实现了工业生产，并且是迄今为止用途最广，产量最大的一个酶制剂品种。按照水解淀粉方式的不同，淀粉酶主要可分为四大类： 萄糖淀粉酶和解枝酶（异淀粉酶）。 制麦过程中的主要糖化力之一，而且 生产麦芽糖浆和高麦芽糖浆，甜味剂和应用于制药业等。 构特点 称淀粉 1， 4要来源于植物和细菌中。根据氨基酸序列的同源性，分属糖苷水解酶类的 14 族（ 1995）。 4 糖苷键，分解得到麦芽糖，当遇到 6 糖苷键的分支点时，则停止不前。因此，当以 链部分生成麦芽糖，而分解点附近及内侧因不能被分解而残留下来，其分解产物为麦芽糖及大分子 过示踪水 过程中，糖苷键 O O 键断裂，这种情况与 酶作用于底物同时发生沃尔登转位反应（ 产物由 此称为 因 能从非还原性末端顺序切下麦芽糖，故又称为“外切”型淀粉酶。 使其还原力直线上升，但不能使淀粉分子迅速的变小，因此，经 精化很慢，与碘发生显色反应只能由深蓝色变浅，而不会变为紫色、红色，以至于 无色。 研究表明直链淀粉、支链淀粉和可溶性淀粉是 于其它底物的分解速率则都有不同程度的降低（ 996； 2003）。 随着研究的深入和 来越多的 了能够资源共享和便于交流，人们建立了有效的和非冗长的蛋白质序列库，比较著名的有：国家生物医药研究数据库（ ; 据库； 本东京大学蛋白质序列数据库；据库。所有已知道的 前有许多研究表明大豆 96个氨基酸组成 (1993； 999)。 目前已知的植物 他都是以单体蛋白 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 形式存在（ 003）。利用 图 1 图 1大豆 通常认为位于分子结构表面的氨基酸由于可以和相邻的分子发生作用，所以如果发生突变就可以部分或完全改变与相邻分子之间的相互作用（ 000； 001）。 为大豆 催化中心的表面，它们最有可能形成分子间二硫键，从而影响分子构型。 研究表明表面作用位点的突变的确可以对 大豆 白表面 点虽多，却受分子构型的影响不会形成分子间二硫键而发生共聚作用 （ 2003） 。 在大豆 的三维结构中具有一个和磷酸甘油醛异构酶相似的由 8 个 （ / ） 结构围成的桶状结构催化活性中心和一个由 8 个氨基酸所组成的可移动环。 以和底物结合并使底物向催化中心底部靠近， 8 个氨基酸组成的可移动环的作用则是把底物的非还原性末端拉入催化中心，催化中心位点为 1993， 1996； N， 1999，2004）。 与 发生不可逆失活（ 1968）；而 酸性条件下都可以保持活性（ 1960）。 是它会受到诸如温度、 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 、溶液中的金属离子浓度等因素的影响。比如盐离子、碘化物、氟化物、和重金属离子可以使 酶不可逆失活；过氧化物和碘等氧化剂使 996） ,不同来源的 物来源的 植物来源的 大麦、小麦、黑麦、和大米等）的种子中，在大豆、玉米和甘薯块茎中也有存在。另外有报道在新西兰水果、紫花苜蓿的根部、芋头的块茎、萝卜的根部以及芥菜的籽苗中都有发现 1994； 996)。 淀粉作用方式虽都一 样，但在作用最适 适温度和等电点上却有所差异（表 1 表 1前己知的植物来源的 来 源 分子量 ( 10 最适 最适温度 （ ） 稳定的 等电点 薯 197 0 豆 5 麦 芽 菜 58 豌豆 56 麦 56 50 卜根 59 0 高粱 20 0 芋头块茎 66&67 0 玉米 65 米 58 5 同植物来源的 3 64等 ,最适温度也从 30 60有很大差别。就目前所知，谷物来源的 种同工酶（ 1987），他们的活性都不受任何辅酶、金属离子和辅基的影响，而且它们大都含有一个巯基基团（高粱属植物除外），这个巯基基团虽然不是 很多的研究表明，它的存在对于 992； 1996）。 在高等植物中，存在两种不同活力的 两种活力的 种是在禾本科植物（如小麦、大麦和黑麦等）的胚乳中以高活力存在的 这类植物的种子在发芽的时候， 高；另一种是以一种相对活性较低的形式普遍存在于植物的各个组织器官中的 两种形式的 在其它方面还是有较多的区别的，而且这两种 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 也有所不同（ 1990），有研究者通过比较分析，推测前一种 994）。 “游离”态和“结合”态两种形式存在。用水提法可以将高等植物中的“游离”态 另一部分以“结合”态形式存在的 需要还原剂或者蛋白水解酶的帮助，这种“结合”态 蛋白 Z 和麦谷蛋白等）结合而成为复杂的不溶物质。这两种形式的 %左右（ P. 1998）。 6 个品种的大麦中提取得到的 果表明不同品种之间的 56 个样品的酶活力从 458 1024U/g 不等，均值为738U/g，这与以前的研究结果一致（ 995； 998） ,这些结果表明在同一植物的不同品种之间和不同生长地的同一品种之间的 生物来源的 在 1940 年就有研究发现许多属于芽孢杆菌属（ 细菌具有 发现多粘芽孢杆菌（ 产生类似于大麦麦芽抽提物的淀粉酶或淀粉酶系。自 1974 年 次确定 外淀粉酶是 继发现了能够产生 这些菌株主要属于芽孢杆菌属。近年来，发现一些放线菌和假单胞菌也能生产 秉旺，1992； 1998）。 细菌来源的 者只有 30的同源性，而且细菌来源的 988； 996）。现将几个有代表性的不同微生物来源的 1 表 1目前己知的微生物来源的 来 源 分子量 ( 10 最适 最适温度 （ ） 稳定的 等电点 7 518 67 7 4 5 35 0 V 2 58 0 5 2 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用。下表（表 1出了最常用的纯化方法。 表 1用纯化方法 物 植物 常规提取方法有两种：一种是直接水提法，一般按液料比 1： 10 效果较好，但这也因不同植物和不同粉碎程度而异；另一种方法是在水提液中加入还原剂，这可以提高提取率（蒋高松， 1994；邱宏端， 1995；古海先，1997）。也有研究者尝试了用甘油法提取 宏端， 1996），这样得到的 是费用过高，无法应用于大规模生产。 由于水提得到的植物中的 淀粉酶，所以要得到纯化的 淀粉酶除去，一般比较常用的除去 析法是最早使用的纯化方法，目前也常被用作所有提纯方法中第一步的粗提方法（ 974；982； 982）。 田亚平单独用使用乙醇分级沉淀的方法提纯 用 1： 杂，再用 1： 集沉淀（田亚平， 2003）。这种方法虽然简单，但是分离效果并不理想， 产物分析结果也证明了，提纯液中还有少量 实验证明用固定化 B 可以将 0 倍，但得到的酶中含有多种同工酶（ 993）。 实践证明要得到高纯度的 用疏水色谱离出具有活力的 滤浓缩洗脱液，再用凝胶过滤色谱 分子量大小将 岩， 1998）； 使用的纯化方法包括：饱和（ 2淀，过 交联葡聚糖柱用凝胶电泳和圆盘电泳分析结果都只得到一条电泳带（ 1995）； 丙酮沉淀和免疫亲和色谱的方法提纯 2001）； 用（ 2淀法和凝胶柱色谱法使酶的总活力提高了 47 倍，回收率达到了 75，最终酶活达 2360U/1999）； 纯化方法包括（ 2性 质 方 法 溶解度 改变离子强度，改变 度，改变介电常数 电荷极性 离子交换层析，色谱聚焦，电泳，等电聚焦 大小或重量 离心分离，透析超滤，凝胶过滤 亲和部位 亲和层析，染料配体亲和 层析，免疫吸附层析，共价层析 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 淀、滤膜透析、阴离子交换色谱和凝胶色谱法（ Y. 1999）； 山芋的的提取液经过离子交换色谱柱和凝胶色谱柱，最后通过 效液相色谱）得到了大小分别为 6667两种纯酶（ 1990），但是这种方法的回收率只有 1，只适合实验室少量时制备使用。 生物细胞的破碎和微生物 微生物 是在纯化之前使用的生物材料的破碎法有较大差异：一般植物细胞破碎多使用机械法；而生物细胞的破碎还可以使用超声波法、冻融法、渗透压法和酶消化法（袁勤生， 2001）。 在遗传学、分子生物学、生物化学、微生物学等学科发展的基础上， 70 年代初形成了基因工程技术（又称为重组 术）。这项技术为任何一种生物接受另一种生物的遗传物质并在其细胞内表达功能和稳定遗传提供了可能，也为我们在试管内直接操作遗传物质改变基因功能、调节基因表达方式创造了条件。经过 30 多年的发展，基因工程技术已被广泛应用于生命科学的各个学科的基础研究，成为微观生物学，甚至宏观生物学有力的研究手段。这项技术也在农业、医药、食品、化工和环保等领域结出了丰硕的应用成果。在基因工程技术的基 础上已出现了蛋白质工程、基因治疗、 物和新一代的代谢工程等多个生物技术生长点。基因工程技术展现了越来越广阔的应用前景。 基因工程技术的核心是基因表达技术。至今，人们已建立了许多基因表达系统，既有原核生物基因表达系统，也有真核生物表达系统。不同的表达系统各有特点。利用基因工程技术进行 物 利用基因工程方法，对于植物 性位点以及不同氨基酸位点对于维持 酶的高级结构的作用展开（ 2003）。到目前为止有许多植物的 基因组 核苷酸序列推导得到，它们之间以及和其它植物来源的 前已有研究者利用点突变的方法提高了在大肠杆菌中表达的大麦 995）。 生物 由于从生物界中直接筛选的原始菌种产酶活力较低，很多学者用物理和化学的方法诱变菌种以提高 国内方面，在对 中科院微生物所做了较多的工作。王惠权和何秉旺以诱变的方法获得变异株（ ,经鉴定为坚强芽孢杆菌。其活力比出发菌株提 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 高了近 300 倍 ,菌株最终产酶活力高达 20000U/45测定）。除了诱变育种外，他们还尝试了改变菌种发酵条件来提高酶活力（何秉旺， 1990），并且以 载体，用鸟枪法从菌种中得到三个产淀粉酶的重组质粒，在大肠杆菌中进行表达。其中重组质粒 生的淀粉酶的淀粉水解主要产物经高压液相色谱分析为麦芽糖。在对重组质粒 苷酸序列推导出氨基酸序列后同已报道的微生物来源的 2、 状芽孢杆菌（ 热硫羧状芽孢杆菌（ 蜡状芽孢杆菌（ 麦和大豆的同源性分别为 98%、 98%、 54%、 49%、 50%、 36%和 36%（陈炜， 1998）。 国外对于 且做的研究工作也要更深入一些。日本神户大学新家龙教授对早期选育方面的研究工作做出了较大贡献，他从蜡状芽孢杆菌 出发菌株，通过诱变，其产酶活力提高 200 倍，酶活力可达 3600U/1979), 但是这样的产酶活力离工业生产距离还较大；高崎义幸也筛选到了一株蜡状芽孢杆菌的突变株（ B. ,这株菌不仅能产较高的 同时还能产茁酶多糖菌 (1983)。为了配合 多科学工作者对水解淀粉 6茁霉多糖酶（ 研究给予了很大的注意(1982)。使用复合酶水解淀粉可以产生麦芽糖 90%以上，这为淀粉酶工业增添了新的生命力。 利用基因工程技术提高菌种的产酶能力，不仅使菌种的产酶量有较大的提高，而且能够改变酶的性质。这促进了研究工作将理论与实践紧密结合，缩短了从探索研究到工业应用的时间，克服了传统育种方法的盲目性。 究目的和意义 如前所述， 虽然多年以来国内外研究者一直注意从微生物中提取 期通过物理、化学方法诱变和改变菌种的发酵条件来提高酶活，近年来也利用基因工程手段使菌种的产酶量有了较大的提高，性质也有一定改良，但目前仍未见工业化使用微生物 前用微生物发酵法生产的 产成本较高的缺点。 植物中提取 本低廉，而且相对而言从大豆中提取的 热性好，作用 目前国内外的大型酶制剂生产厂家生产的工业用的 高等植物，主要是从大麦，小麦，麦芽，甘薯和大豆中提取。日本、美国、丹麦等国家对植物 其是日本以大豆为原料生产 0 年的历史；美国用小麦提取的 泛应用于生产高麦芽糖浆，麦芽糖醇以及啤酒等产品，取得理想的效果。耐热淀粉酶在食品及饮料工业中有很大的应用价值，因为高温不仅可以增加淀粉的可溶性，而且可以防止杂菌的生长，这对于降低生产成本是十分有利的。 我国是大豆的故乡，大豆栽培在我国迄今已有 5000 多年的历史，我国的大豆品种达千余种。本研究 充分发挥农 科院品种资源优势，对核心种质库中的 184 个大豆品种的酶活力和耐热 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 8 性进行测定，并利用分子生物技术将筛选得到的具有高酶活力和高耐热性的品种的 因在大肠杆菌中进行表达。 这些研究工作为我国的大豆种植业和 大豆 为后续的研究工作奠定了基础。 中国农业科 学院硕士学位论文 第二章 耐热大豆 9 第二章 耐热大豆 麦芽糖及用于食品加工业，在医学领域可用来帮助消化以治疗消化功能不全和退化，在饲 料领域可作为饲料添加剂。 物来源的 围宽，而且在微酸性至中性条件下热稳定性良好，目前 豆是生产 是，有关我国大豆资源所含 此本文对我国核心种质大豆资源库中的大豆 料与方法 料 试样品 大豆核心种质于 2003 年种植于北京昌平试验基地，收获后装入牛皮纸袋于 4保存。 验仪器 00E, 紫外检测器为 81 型，分子筛凝胶柱 200000瑞典 司产品，精密恒温水浴锅 美国 司产品，粉碎机、水浴摇床、离心机等均为国产。 剂 3， 5二硝基水杨酸、可溶性淀粉、麦芽糖及其它试剂均为国产分析纯。 法 采用酸性水提法 (参照朱婉华等人的方法略作修改 )：大豆用高速粉碎机粉碎成粉末，称取200粉放入 10盖的离心管中，加入 4馏水，用旋涡混合仪混匀后边震荡边缓慢加入 1 盐酸溶液（最终 为 然后置于摇床震荡提取 1h（ 150 转 /分钟，16 20），之后再边震荡边缓慢加入 1 回至中性，最后离心（ 3000 转 /分钟， 10 分钟）取上清液，此液即为 4冰箱保存，使用时适当稀释。 中国农业科 学院硕士学位论文 第二章 耐热大豆 10 参照 人的方法略作修改。于试管中加入 %可溶性淀粉水溶液和 ， 50预热 5加入 当稀释的酶液，50保温 30即加 液终止反应，沸水煮 5色，自来水冷却至室温，用蒸馏水补足至 分振荡后测 550吸光值，以麦芽糖作标准曲线计算麦芽糖含量。空白对照先加 液再加酶液。酶活力单位定义为在该条件下（ 50）每小时生成1个酶活力单位。 稳定性测定 、 0 倍，于 63下保温 5h，然后测定剩余酶活性。 豆 定 取 当稀释的酶液加入到 系列 冲液（ ， 50预热 5加入 预热的 2%淀粉溶液，于 50反应 30 适反应温度测定 取 度 2%淀粉溶液（ 入到 当稀释酶液中（均预热），于不同温度下反应 5h，以相对酶活性表示。 稳定性的影响测定 冲液 ()适当稀释，于 63保温 5h，取 %淀粉 (应 30未保温酶液的活性为 100%计。 定分子量 取 200豆粉末放入 10心管中，加 5、 酸缓冲液，摇床提取 1h（室温， 26），然后 4离心（ 10000 转 /30取上清液在相同条件下再离心 15 50子筛凝胶柱，用 、 磷酸缓冲液洗脱，流速 1mL/测波长 280部收集洗脱液，每管 管取 200L 测定 子量标准蛋白为牛血清白蛋白和溶菌酶蛋白，浓度为 5mg/样体积 50L。 中国农业科 学院