第八章微生物遗传2006.ppt

第八章微生物遗传与变异,通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、基因表达的调控重点：细菌的基因重组难点：低频转导，高频转导，准性生殖,第一节遗传的物质基础,第二节微生物的基因组结构,第四节真核微生物的基因重组,第三节原核微生物的基因重组,第五节基因突变和诱变育种,第七节微生物与基因工程,三个经典实验的原理与方法，朊病毒的概念,原核及真核微生物基因组的基本特征,基因突变的规律,三种基因水平转移方式及其应用,微生物菌种保藏的基本方法,准性生殖,第八节菌种保藏,基因工程的基本过程和基本技术,第六节微生物基因表达的调控,遗传：,亲代与子代相似,变异：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一,遗传型：(genotype),表型：(phenotype),决定生物表现型的遗传因子,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。,表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。,遗传型环境条件,表型,表型饰变：,同样遗传型的生物在不同外界条件下显现的不同表现型的变异，不涉及遗传物质结构改变特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,遗传型改变引起的表型变化，发生在基因水平上，可以遗传给子代。特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）,遗传型变异（基因突变）：,Serretiamarcescens在25下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成鲜红色。可是，当培养在37下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25，产色素能力又得到恢复。,Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens（粘质沙雷氏菌）.Fromlefttoright:slantculturegrownat25C,slantculturegrownat37C,brothculturegrownat25C,brothculturegrownat37C.,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体,方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。物种和代谢类型多样对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株,操作性强。,第一节遗传的物质基础,一.证明核酸是遗传物质的经典实验1928年，F.Griffith；1944年O.T.Avery肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）转化试验。1952年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌体感染实验。1956年，H.Fraenkel-Conrat的TMV拆开和重建实验。,1、经典转化实验肺炎双球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）,1928年，F.Griffth的转化实验,1944年，Avery的转化实验，确定了转化因子,实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA！,2、噬菌体感染实验,实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。,32P标记DNA,35S标记蛋白质,3、植物病毒TMV重建实验,实验证明，TMV的遗传物质是RNA。,结论：,证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题微生物与高等生物具有共同的遗传本质,Prusiner(1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒（proteinaceousinfectiousparticle），并将之称做Prion或Virino。-朊病毒,1997年，StanleyB.Prusiner荣获诺贝尔奖,朊病毒的发现和思考:,朊病毒一种具有传染性的蛋白质致病因子,蛋白质是遗传物质吗?蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？,已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸,二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式,(一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式,真核生物DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。高等生物中有2至多套染色体（动物2倍，水稻4倍），真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。,原核生物DNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。质粒plasmid和转座因子原核生物中，除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。,1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,（二）遗传物质在7个水平上的形式,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,3、染色体水平染色体的数目在不同的生物中是不同的,真核生物染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有闭合环状的DNA链原核生物为单倍体,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。,5、基因水平,一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。,1909年丹麦生物学家WJohansen,结构基因：是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。重复基因：DNA片段重复跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子、Tn因子）,6、密码子水平,核苷酸是最小突变单位和交换单位,7、核苷酸水平,（三）转座因子,转座因子：细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。,插入序列（insertionsequence,IS),转座子（transposon,Tn),某些病毒（Mu噬菌体）,原核生物的转座因子：,型Compoundtransposons：两端为IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。型Complextransposons：两端为IR(30-50bp)，中间为转座基因和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。,基因转座genetransposition,转座子的特征是在两端有IR序列,分两类：,转座的遗传学效应：,1）插入突变,2）产生染色体畸变,3）基因的移动和重排,(四)质粒,1、致育因子(Fertilityfactor，F因子),3、产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）,2、抗性因子（Resistancefactor，R因子）,4、毒性质粒（virulenceplasmid）,5、代谢质粒（Metabolicplasmid）,6、隐秘质粒（crypticplasmid）,第二节：微生物的基因组结构,明确基因组的概念，微生物在人类基因组计划中的独特而重要的地位；人类基因组计划对微生物学发展的影响（反求遗传学）；三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基因组的独特性及双重特征；随着基因组全序列测定微生物的增多所发现的新问题：水平基因转移现象Woese系统发育树面临的挑战,微生物基因组结构的特点:,1、原核生物（细菌）的基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短.,基因组genome：一种生物的全套基因。,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；4）重复序列多.,第一个完成基因组测序的真核生物基因组,3、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组,第一个完成基因组测序的古生菌,1)只有40的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌1.66x106bp的环状染色体DNA1682个ORF(OpenReadingFrame)3)负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻译）则类似于真核生物,克隆clone不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。基因重组generecombination两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进行。,第三节原核微生物的基因重组,一、细菌的接合作用(conjugation),1.实验证据,通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程,接合(conjugation)通过供体菌与受体菌间细胞接触而传递大段DNA,1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.TatumE.colik12的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。,证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）,接合机制(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。,中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！,为何采用多重营养缺陷型菌株？,尽可能地排除回复突变对实验结果的干扰！,1）可经接合作用而获得2）可通过一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、利福平、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。3）在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%,F因子特点：,F因子,大肠杆菌是有性别分化的。决定它们性别的因子称为F因子(致育因子或称性质粒)，呈超螺旋状态，既可以在细胞内独立存在,具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中的能力,也可插入(即整合)到染色体上,F因子的四种形式：,a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上,因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。,F+菌株含F质粒，细胞表面产生性毛(sexpili)，与F-细胞相连，在接合后转移DNA。F-菌株无F质粒，不产生性毛，可接受外来F质粒。,Hfr菌株高频重组菌株（highfrequencyrecombination）。与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。当Hfr菌株与F-菌株接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100min。由于转移过程常中断，越在前端的基因进入F-的机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。,F菌株携带有F因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F菌株。初生F菌株与F-菌株接合，使后者转变成F菌株，这就是次生F菌株。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction)。在次生的F群体中，大约有10%的F因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。,1）F+F-杂交,1）F+细菌通过性毛与F-细菌接触并发生相互作用；2）F因子的转移:双链之一被切断，一条链进入F-细菌3）进入F-细菌中的一条链复制出互补链,F-成为F+4）原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制,F+F+,2）HfrF-杂交,Hfr菌株仍保持着F+细胞的特征。当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区和染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区外，绝大部分处于转移染色体的末端，因转移过程常被中断，故F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的接合子多数仍然是F-。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,HfrF-,3）FF-杂交,FF-与F+F-的不同：供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）,FF,1、普遍性转导（generalizedtransduction）,(1)意外的发现,1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,二、细菌的转导(transduction),1952年Zinder和Lederberg在验证Salmonellatyphimurium是否也存在接合现象时发现了转导现象。S.typhimurium：LT22A(trp-)；LT2(his-)LT22溶原性噬菌体P22感染LT2（非溶原性）可能释放带trp+的P22LT22A(trp-)呈原养型。,沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株是非溶源性细菌,一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！,基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的,（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）,WhyandHow?,（2）转导（transduction）,转导：由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式。一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。,转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子。,细菌转导的类型：,普遍转导,低频转导高频转导,局限转导,完全转导流产转导,普遍转导（generalizedtransduction）,噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)转导至受体细菌中，并使受体菌实现各种性状的转导,普遍性转导的三种后果：,外源DNA被降解，转导失败。,完全转导,流产转导,完全转导completetransduction：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子(transductant),转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物。,流产转导：,局限性转导是噬菌体对寄主特定基因进行的有效转移溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体DNA与受体菌的DNA同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形成转导子。,局限转导（又叫特异转导）：,specializedtransduction,如：前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和bio，经诱导后噬菌体与寄主DNA分离。但在极低的频率下会出现错切，从而使邻接的的细菌DNA被一起切除转导至受体菌。,局限性转导包括低频转导和高频转导两种类型,低频转导：,低频转导裂解物,正常噬菌体,极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）,转导颗粒,局限转导子（极少量）,低感染频率,形成转导子的频率只有10-4-10-6,高频转导：,形成转导子的频率很高,理论上可达50%。,高频转导是双重溶源的结果：E.colik12E.coliK12(/dgal)FdgalUV转导噬菌体（gal）转导子菌落辅助噬菌体（）噬菌斑,局限转导与普遍转导的主要区别：,a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,转化：指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。这些被转化的游离的DNA片段称为转化因子。转化后的受体菌，称为转化子。,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,三、细菌的遗传转化（genetictransformation）,感受态细胞：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。,进行转化，需要二方面必要的条件：,1、建立了感受态的受体细胞,2、外源游离DNA分子（转化因子）,自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内,转化因子通常是双链DNA。,转化过程:,感受态的出现转化因子的吸附与掺入转化因子的整合,噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒,转染(transfection)：,转染的特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。,人工转化：,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,五.原生质体融合,原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）原生质体融合成为一个新的重组子的技术。,原生质体融合步骤：,1、原生质体制备2、原生质体融合和再生3、融合子的选择,微生物细胞融合的研究始于1976年。主要过程：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。,杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。,（一）有性生殖,第四节真核微生物的基因重组,能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交,（二）准性生殖,准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它是类似于有性生殖，但比之更为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。,2、异核体形成,1、菌丝联合,3、核配,4、体细胞交换和单倍体化,杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。,准性生殖的过程：,第五节基因突变和诱变育种,基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可遗传的改变。,野生型（原始性状）,基因突变,突变型（新性状）,一、基因突变的定义,自发突变,诱发突变,回复突变,基因突变分为,二、基因突变的类型,同义突变,错义突变,无义突变,移码突变,不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：,常见的微生物突变类型：,1、营养缺陷型（auxotroph）,特点：,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长,负选择标记,（突变株不能通过选择平板直接获得）,缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型。,营养缺陷型,Lederberg夫妇在1952年建立影印平板（Replicaplating）法,2、抗药性突变型（resistantmutant),由于基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性的突变型。,3、条件致死突变型(conditionallethalmutant),在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。,4、形态突变型(morphologicalmutant),指造成形态改变的突变型。,5、其他突变型,如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性突变型等。,1）自发性2）不对应性3）稀有性4）规律性,三、基因突变的机制,5）独立性6）可诱变性7）遗传性8）可逆性,1、基因突变的特点：,基因突变自发性和不对应性的实验证明：,野生型（原始性状）,特定环境,突变型（适应环境的新性状）,驯化,定向诱变,筛选,？,？,？,突变的原因,？,一种观点认为，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”、“驯化”。另一种观点认为，基因突变是自发的。,三个经典实验变量实验、涂布实验、影印实验1943年S.E.Luria与M.Dlbruck进行了Fluctuationtest1949年H.B.Newcombe的Respredingplatedincubacion1952年J.Lederberg夫妇用Replica-plating结束了争论,证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,如何证明基因突变的自发性？,变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）,Newcombe的涂布实验（1949）,影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）,变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）,SalvadorLuria,MaxDelbruck,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969,影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）,JoshuaLederberg,J.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958,2、自发突变的机制,主要的原因是：碱基互变异构体的存在导致形成不同的碱基配对。,腺嘌呤氨基式AT配对,腺嘌呤亚氨基式AC配对,结果：导致ATGC,碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。,3、诱发突变的机制（1）碱基的置换（转换、颠换）碱基对置换substitution转换transition：颠换transversion：,（2）移码突变frame-shiftmutant：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误,（3）染色体畸变chromosomalaberration：缺失、重复、插入、易位、倒位,A、碱基类似物-5-BU尿嘧啶引起碱基的转换,5溴尿嘧啶（胸腺嘧啶结构类似物）,4、诱变剂,B、插入染料,C、与DNA碱基直接起化学反应的诱变剂亚硝酸引起DNA的碱基转换,D、辐射和热,嘧啶,嘧啶二聚体,UV,“生物化学统一性”法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果,所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性,让细菌代人受过！,Ames试验：,利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用,美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变,证明Ames试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免,四、DNA损伤的修复,1、光复活作用,嘧啶二聚体,嘧啶,光解酶,2、切除修复,3、重组修复,4、SOS修复,DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。,错误倾向的SOS修复,五、微生物诱变育种,诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。,诱变剂,物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、r射线等,化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物,（2）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液,（1）使用简便有效的诱变剂,（4）使用最佳的处理剂量,剂量=强度（浓度）作用时间相对剂量=杀菌率,处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应,致死剂量：将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存活在10%以下。弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%诱变处理一般选用亚致死剂量。,（5）设计高效率筛选方案,突变株的筛选：产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）,影印平板法,生长谱法,自发突变育种breedingbyspontaneousmutation生产育种定向培育诱变育种breedingbyinducedmutation用物理（X-ray、UV等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。,六.微生物育种,第六节微生物基因表达的调控,一、操纵子（operon)的转录调控,操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因(operator)和启动区（promoter)的调控。,1、负转录调控（negativetranscriptioncontrol),调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻遏蛋白可以与操纵区结合，起着阻止结构基因转录的作用。,2、正转录调控（positivetranscriptioncontrol),调节基因的产物是激活蛋白（activator），激活蛋白与相应的激活结合位点结合，激活结构基因的转录。,1）负控诱导系统,a、没有诱导物存在时，阻遏蛋白与操纵区结合，阻止转录b、有诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合而不再和操纵区结合，转录正常进行。,典型：大肠杆菌的乳糖操纵子,2）负控阻遏系统,a、没有辅阻遏物存在时，阻遏蛋白不与操纵区结合，转录进行b、有辅阻遏物存在时，与辅阻遏物结合的阻遏蛋白可以与操纵区结合，转录被阻止。,典型：大肠杆菌的色氨酸操纵子,3）正控诱导系统,激活蛋白与诱导物结合后被活化，与激活结合位点结合，从而促进RNA聚合酶与启动子结合。,(b),典型：麦芽糖正控诱导系统,第七节微生物与基因工程,了解微生物学在基因工程技术的建立与发展中的重要意义，了解并掌握基因工程的基本过程和基本技术。,一、基因工程,基因工程：在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。,克隆载体（cloningvector）负责将外源DNA片段运送到细胞中进行复制与扩增。,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类核酸内切酶。,微生物学与基因工程的关系,微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术。,基因工程概述,基因工程geneengineering人工将供体生物的遗传物质-DNA在离体条件下用适当的工具酶进行切割，把它与载体(vector)的DNA分子连接，然后与载体一起导入某一受体细胞中，让外源遗传物质进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,基因分离：体外重组：外源DNA与载体连接载体传递：导入受体，使外源DNA在受体中表达复制、表达筛选、繁殖：对重组后的大量重组子性状进行筛选，从中选出所需性状重组子，并使之稳定繁殖。,过程,获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用,二、基因工程的基本操作,微生物在基因工程中的作用：1.微生物作为克隆载体:质粒、病毒、噬菌体2.微生物生产基因工程工具酶；1)、限制性核酸内切酶2)、DNA连接酶3.微生物作为克隆载体的宿主；1)、原核生物宿主大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2)、真核生物宿主酿酒酵母4.微生物作为基因产物的重要表达载体。5.理论基础（主要来自对微生物的研究）；6.微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源。,2.微生物与基因工程工具酶,基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）,DNA聚合酶,碱性磷酸脂酶,核酸外切酶,单链核酸内切酶,其它工具酶：,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）,基本特点：,识别序列；切割形成粘性末端；切割形成平末端；同裂酶；同尾酶；,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13噬菌体载体,真核细胞的克隆载体,人工染色体,噬菌粒载体,3.微生物与克隆载体,常用的基因工程宿主,1）大肠杆菌,3）酿酒酵母,2）枯草芽孢杆菌,特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚,4）动物细胞,4.微生物作为克隆载体的宿主,DNA的体外扩增穆利斯发明了聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR），这是一种在体外模拟细胞内进行的快速扩增特定DNA序列的新技术。PCR扩增的条件：DNA摸板引物脱氧核苷三（dNTP）磷酸DNA聚合酶扩增缓冲液钙离子,基因工程的常用技术和方法,