【毕业学位论文】（Word原稿）小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Nested PCR检测植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的 f. f. I 摘 要 小麦白粉病是小麦生产上的主要病害之一，病害流行的预测预报和风险估计是综合防治的重要部分。尽 早、准确地估计病害发生趋势是有效的预测预报的关键。虽然我国小麦白粉病发生规律因地区和气候条件而异，但对越冬麦苗和越夏自生麦苗的潜育侵染程度做及时、准确 的 监测成为不同地区病害预测预报和风险估计中普遍存在的关键环节。而这方面的进展受到传统、落后方法的制约，如叶片或幼苗取样培养的方法耽工、费时、灵敏性差。快速发展的分子生物学技术显示了有效改进流行学方法的巨大潜力。本研究应用分子生物学原理、技术和方法探讨准确、快速地测定小麦白粉病潜育侵染的新方法，为改进流行学的传统监测方法奠定了基础。 本研究根据小麦白粉菌（ f. 糖体内转录间隔区（ 列设计合成常规 物 1、 1、 1。应用小麦其它病原真菌做参照，表明所设计的三对引物 均对小麦白粉菌有特异性，能区分小麦白粉菌和其它麦类病害。 其中 1 较 1、 1灵敏性更高，可检测到 1粉菌 在 筛选获得的特异性引物 1 所扩增产物的序列基础上， 设计合成了 外引物，并对其进行灵敏性测定。应用所设计的 程， 从纯培养的病原菌中可检 测到的最低病菌 量为 本研究建立了从小麦病叶中提取白粉菌 技术。 应用常规 室内用不同接种量人工接种白粉菌后在不同潜育侵染阶段取样的小麦叶片做病原菌的 定分析。用最低接种量 300个孢子 /，采用常规 用 从接种 1d 后的小麦叶片中检测到潜伏侵染的白粉菌。 在人工接种的条件下常规 检测相同程度的潜伏侵染至少提前 2潜育侵染早期和接种浓度低时， 常规 检测效果上有明显优势。 从北京和山东两地的秋苗上，共选取 11 个采样点对人工接种小麦白粉菌或自然侵染的叶片取样，用常规 未显症叶片的检测结果表明， 常规 定的叶片侵染率对叶片离体培养测得的侵染率的直线回归预测式只在 平上显著 （ P = 有 6 个样点未测到侵染病叶。而 定的叶片侵染率与叶片离体培养测得的侵染率的直线回归式极显著 ( P = 此结果表明， 法的预测性比常规 法要好，但其预测结果比实际叶片侵染率偏高，显示 高灵敏特性。本研究 对小麦白粉病的早期、快速 和准确 的监测 及 预测预报有实际应用价值。 关键词 ：小麦白粉菌 ， 伏侵染，病害监测 by f. is of of as an in of to is a in in of a of is to in as of of to on or is of a to in of to a be to of of . f. on of to in by in of by 1、 1、 1) on of . f. of by of of 1/R1 a of 2/1, as NA . A CR an an on CR 1/of CR as as .1 fg by of A NA in of by on of to CR to in of 00 cm of NA in CR CR CR -3 CR a CR in of at CR to of A of to of CR to a of CR = 1 CR CR = a of CR CR in of of . f. CR a in be to of in f. 录 第一章 引言 1 麦白粉病概述 1 麦白粉病发生、分布和危害 1 害症状 1 原菌形态及生物学特性 2 害侵染循环和生活史 2 物病害和病原菌的监测 3 物病害的监测 3 物病原菌的监测 3 种常用分子标记技术 4 子技术在植物病原菌检测方面的应用 5 原菌分子检测的灵敏性与病害的早期监测 6 研究内容、目的及意义 8 第二章 常规 物的设计及其特异性与灵敏性分析 9 料与方法 9 试植物材料来源和准备 9 试菌株来源、收集与保存 9 试材料的 取 11 原菌的常 规 14 规 物的特异性检 测 17 规 物灵敏性测定 17 果与分析 17 原菌 测 17 规 物特异性的检测 18 规 物灵敏性测定 20 结 22 第三章 23 料与方法 23 物设计 23 引物的特异性分析 23 引物的灵敏性测定 24 程 24 灵敏性分析 24 果与分析 24 引物特异性分析 24 V 引物灵敏性测定 25 灵敏性测定 26 常规 敏性的比较 26 结 28 第四章 人工接种叶片的潜育侵染测定 29 料与方法 29 试植物材料和白粉菌菌株 29 试材料的准备 29 工接种 29 样 29 麦叶片基因组 提取 29 工接种的小麦叶片中的白粉菌 测 30 据分析 31 结果与分析 31 规 测小麦叶片中显症白粉菌 31 同侵染量未显症小麦叶片中白粉菌的 测 31 结 35 第五章 田间小麦叶片潜育侵染的测定 36 料与方法 36 验材料的获得 36 规 测 36 据分析 36 果与分析 36 国农科院植保所农场试验田小麦叶片常规 间检测 36 东烟台大庄头村小麦叶片常规 间检测 37 常规 法估计田间侵染叶片的潜育侵染率 38 结 40 第六章 结论与讨论 42 论 42 论 42 进的 提取小麦白粉菌、小麦锈菌 优势 42 于利用 计引物 43 43 症时期 测与最终发病率关系 44 于 改进 45 研究的创新点和在流行学和病害防治方面的应用价值 46 参考文献 47 附录 52 谢 55 作者简历 56 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 麦白粉病发生、分布和危害 小麦白粉病是由专性寄生真菌 f. 起的气传性病害。在世界各主要产区均有发生，其中以欧洲的发病最为严重。如英国 1959 年至 1962 年之间，白粉病危害损失为 70 公斤 /公顷，奥地利 1971 年小麦产量损失为 5 20；美国东部各州尤其是东南部沿大西洋和墨西哥湾各州，白粉病一直是小麦生产上重要病害；印度、新西兰等国家因白粉病危害小麦产量损失达 45。前苏联小麦生产区也常常大面积发生白粉病，危害异常严重（吴兆苏， 1990）。我国小麦白粉病是由戴芳澜先生于 1927 年首先在江苏省发现。过去主要在我国西南各省 和山东沿海地区发生较重， 20 世纪 70 年代后期以来小麦白粉病日益扩展蔓延北移，全国已有 20 多个省市发生，以西南地区和河南、湖北、江苏、安徽等地发生较重，而且西北地区和东北辽宁等省春麦区，也日趋严重（何家泌等， 1998；刘万才等， 1998；孙黛珍等， 2004）。 1990 我国小麦白粉病发病面积达 1207 万公顷，占全国小麦总面积（ 3037 万公顷）的 39%，粮食损失达 4 亿公斤 （朱建祥 1992）。 目前小麦白粉病发病面积已居小麦四大病害之首（白粉病、锈病、赤霉病、纹枯病）（谢皓等， 1998）。 害症状 小麦从幼苗至成 株各生育阶段均可受白粉菌的侵害。小麦白粉病发病特点是先在田间出现发病中心，然后由发病中心向全田水平扩展。其侵染部位主要是叶片，但严重时叶鞘、茎秆和穗部也可受害。早期发病的植株，看不到明显的症状。随着病情的发展，在叶片上开始出现褪绿斑，而后逐渐扩大为近圆形或椭圆形的病斑，表面覆有一层白粉状霉层，发病严重时，病斑连成一片形成大片白色至灰色霉层。一般叶片表面比背面发生重，下部叶片比上部叶片受害重，霉层厚度可达 2 右。霉层中的白粉菌菌丝初生时为薄丝绸状，其先产生病菌无性阶段分生孢子，后期白粉状霉层逐渐由灰 褐色变为黄褐色至黑褐色的小圆粒即病菌有性阶段的闭囊壳，导致叶片褪绿发黄乃至枯死。小麦颖壳受害时能引起枯死使麦粒不饱满甚至腐烂，发病严重的病株矮而弱，不抽穗或抽出的穗短而小（何家泌等， 1998）。 原菌形态及生物学特性 白粉菌是以菌丝寄生在寄主表面，并以吸器伸入寄主表皮细胞吸取营养，菌丝上垂直着生短形的分生孢子梗和分生孢子。小麦白粉菌的分生孢子成串地着生于分生孢子梗上，自顶端而下逐个成熟脱落，由气流传播引起再侵染。分生孢子的寿命较短，侵染力只能维持 3 4天，发病植株上的灰白色粉层状霉层就是病菌的分生孢子及 菌丝。植株感病后期在霉层中产生的黑褐色小点，即菌丝丛上产生的闭囊壳为病菌的有性世代 (何家泌等， 1998)。 小麦白粉菌对湿度的适应范围很宽，分生孢子在相对湿度 5% 100%下均可萌发和侵染，湿度越大，萌发率越高，但在水滴中萌发率反而降低。分生孢子在 30 温度范围内均可萌发，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 但以 10 20 为最适宜，直射阳光对孢子萌发有抑制作用，所以小麦植株过密，通风透光不良或阴雨天气等条件下病害发生最重 (郭小山等， 2006)。 害侵染循环和生活史 病菌的孢子随气流传播到感病品种的植株上，遇到适宜条件即萌发长出 芽管，芽管前端膨大形成附着胞，并产生较细的附着丝直接穿进叶表面的角质层，侵入表皮细胞，形成初生吸器，吸收寄主营养，并向寄主体外长出菌丝，随后在菌丝丛中心产生分生孢子梗和分生孢子，分生孢子成熟后脱落，由气流传播引起再侵染，病菌在植株生长后期进行有性生殖，在菌丝丛上产生闭囊壳，闭囊壳成熟后在适宜条件下释放子囊孢子侵染植株致病（图 1 1）。 图 1 1 小麦白粉菌侵染过程示意图 生芽管 ； 丝扩展 ； 囊壳、子囊及子囊孢子。 (11989，原图 ； 1971，原图 ) . f. in 麦白粉菌的越夏方式有两种 ： 一是以分生孢子在夏季气温较低地区（旬平均 24 以下）的自生麦苗或夏播小麦上继续侵染繁殖，或以潜育菌丝状态渡过夏季。如贵州的贵阳地区、四川的雅安和川北的阿坝州、湖北的鄂西北及鄂西山区、河南 的豫北和南阳地区、陕西中秦岭北麓及渭北山区、甘肃天水地区等等。而在广大的平原区，由于夏季气温较高，病原菌难以存活，加上大多数自生麦苗到播前已经死亡，因此小麦白粉病菌不能在这些地区越夏。小麦白粉病另一种越夏该方式是以病残体上的闭囊壳在低温干燥的条件下越夏。越夏菌源成为秋苗发病的初始侵染源，使秋苗受侵发病。入冬后病菌越冬也有两种方式，当气温较高时，病菌以分生孢子形态在麦苗表面越冬；而当气温较低时以菌丝体潜伏在寄主组织内越冬。影响病菌越冬存活率低主要因素是冬季气温和湿度，如冬季温度高，雨季较多或土壤湿度大，则有利 于病菌越冬。早春气温回升，小麦返青后，病菌开始侵染循环过程并造成为害（何家泌等， 1998； 董金皋， 2001；刘万才， 1994）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 物病害和病原菌的监测 物病害的监测 植物病害流行系统的监测（ of 对病害流行系统的实际状态和变化进行全面、持续、定性与定量的观察、表述和记录。病害的流行系统的监测不仅要获取某种病害发生状态的时序数据，而且要对病害流行系统的各个组分和影响因素进行观测，包括寄主、病原物、环境和人类的耕 作栽培活动。植保工作是对有害生物的系统管理。在一定防治目标要求下，防治决策是管理的核心，预测是决策的基础，实况监测是预测和决策必不可少的依据。监测的目的是在生产上为进行有害生物的预测和防治决策提供可靠的依据，在科学研究上为有害生物发生发展规律和预测方法的研究服务 (曾士迈等， 1994；肖悦岩等， 1998)。 在制定监测的项目、方法和标准时，首先要考虑病害预测或病害管理的具体要求。（ 1）若为了掌握病害逐年发生情况需要了解生产田中病害发生和危害程度以决定是否需要防治时。这类调查时间应选在该病害防治时期或作物形成产 量的关键生育期或病害发生盛行期，调查项目单一，方法简便，注重大范围普查和分类调查，不苛求精度。常以病害种类、病田率、病点率为代表。（ 2）若要了解病害发生的动态规律，做好预测工作，则要坚持定时、定点、定量的病害调查，强调数据规范性，以便长期积累、比较。（ 3）若要进行某一病害流行学研究，则需对该病害系统的主要组分进行监测。这要求对病害的系统调查以及对有关气象因素、栽培条件、寄主状况进行观测，还要注意、对比调查和特殊项目的监测（肖悦岩等， 1998）。 对植物病害的监测，目前主要是采用人工调查病害的发生强度即病情， 常常调查病害发生的普遍率（ 严重度（ 病指（ 来代表病情的严重程度。 植物病原菌的数量是病害流行的一个重要驱动变量，病原菌的侵染能力、生存力、传播能力与病害的流行速度、流行长短及分布有很重要的关系，而且病原菌与寄主基因型、生育阶段、环境的互作及病原菌的遗传影响病原菌在当前流行季节和下一个流行季节的菌量和流行潜能（周益林等， 2004）。因此病原菌监测工作在研究病害流行也是至关重要的。如子囊壳成熟进度可作为小麦赤霉病 、梨黑星病等病害中短期预测的依据， 对病原菌的监测方法视具体的病害特点而定。空中孢子密度的监测常用于气传病害，孢子捕捉方法有：凡士林玻片法，培养基平面玻皿法，孢子捕捉器法，还可采用定点置放的或车载移动的生物捕捉法。车载移动的生物捕捉法就常用于小麦白粉病菌等专性寄生病害的监测。其中凡士林玻片法、培养基平面玻皿法经济且简单易行，适用于较大孢子，但易受旋风、涡流影响，捕捉效能不高，不适于定量准确度要求高的监测工作。孢子捕捉器法，特别是移动式孢子捕捉器具有效率高、取样均匀、范围大、样本代表性高 ， 不破坏捕捉的孢子等特 点，用此代替传统的人工调查方法，可大大降低工作量，提高效率。对土传病害常用土壤带菌量来监测病原物及其动态，土壤中病原物定量测定分为直接计数和不能直接计数两种方法。直接计数的如菌核、线虫、真菌孢子等能目测或镜检计数的。不能直接计数的，则需选用选择性培养基进行定量分离，以定量土样培养出的菌落数反应土壤中病原物的量或其发病强度，或者进行生物测定，以指示植物的发病数中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 量反应土壤中该病原物的多少。选择性分离和生物测定当方法标准化后，可以获得可重复的可靠数据，但当监测的地块很大、土样很多时，所需的试验室或温室的工作量很大 。 在病害流行学研究中，为减免病原物数量测定的繁难，常用病害数量间接估计 “菌源量 ”（病原物群体数量）。这类观测，大多是通过肉眼观察和仪器测量获得测量值和估计值，或通过抽样调查和数理统计获得相对可靠的代表值。但它的代表性也有很大局限性，因为能够测计的病害数量只能是以发病的，而潜育状态的那一部分病害也许不多，也许很多，却是无法目测的。如小麦条锈病为例，流行条件适合时，潜育量可达发病量的几十上百倍（曾士迈等， 1994）。目前传统病害和病原菌监测的方法主要存在的问题是工作繁琐费时，耗费大量人力物力，工作量大，效率较 低 ， 且很难准确测定或监测病害处于潜伏状态时的菌量等。而现代生物学方法如生化和分子生物学方法和技术能够提供更快速、经济、简便、易行的方法，可解决传统方法很难解决的问题。 种常用分子标记技术 近十多年来，现代生物科学发展突飞猛进，生物技术特别是分子标记技术也有很大的发展，在各个领域的应用也日趋成熟，被广泛应用于生物起源进化、系统分类、物种多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定位、基因定位克隆等领域的研究（陈文炳等， 1997；傅荣昭等，1998；邱芳等， 1998；龚鹏等， 2001；陈文炳等， 2001；郭金平等， 2003）。 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的遗传标记。它是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的最为理想的遗传标记。广义的分子标记技术指生物大分子水平上应用于区别物种的标记技术，包括 蛋白质 (包括酶类 ) 等分子水平的标记。狭义的分子标记技术仅指 记。 子标记检测技术大致可分为三类 : 第一类是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有 二类是以电泳技术和 术为核心的分子标记技术，其代表性技术有 ; 第三类是以 列分析为核心的分子标记技术，其代表性技术为 列分析。 以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记 是利用限制性内切酶消化不同生物体的 子，电泳后用特异探针进行分子杂交，通过放射性自显影或非放射性同位素显色技术来揭示中最具代表性的是发现最早和迄今应用最广泛的限制性片段长度多态性(记。 失、重组或突变，利用限 制性内切酶消化基因组 产生大小不同的泳后通过 这些大小不同的 后同特异的探针进行杂交，最后通过放射性自显影或其他显色技术显示杂交结果，从而揭示出 et 1989； et 1987）。 标记是以重复序列为探针进行分子杂交，由于不同基因型中的重复次数不同而产生多态性的分子标记。微卫星 (数为 2 4个）为单位多次串联重复的用某个微卫星 端的保守序列设计一对特异引物，扩增这个位点的微卫星列，经聚丙烯酰胺电泳即可显示不同基因型个体在这个 谊等，2001）。小卫星（ 个 11 60个核苷酸的基本序列单位重复排列而成， 其重复数从 10到 10000不等，分散或成簇分布。多态性的产生是由于重复单位之间的不平衡交换，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 从而产生不同的等位基因。（吴敏生等， 1998；危文亮等， 2000）。 以 电泳技术和 便、快速和高效等特点迅速成为分子生物学研究的有力工具。随机扩增多态性 (记通常以 10碱基的寡核苷酸序列为引物，对基因组 而得到多态性图谱作为遗传标记的方法(et 1990)。 是通过对多态性计一对新的引物特异地扩增一个在特定位点的 般在原与 5端延长 14个碱基，利用两端各 24个碱基的引物进行特异扩增（李志英， 2004）。扩增片断长度多态性 (标记系统是基于 原理为基因组 限制性内切酶消化，然后连上一个接头 (，利用两个选择性引物进行 引物含有接头和酶切位点序列，并且其 3端加上了 2 3 个随机核苷酸，即：引物 = 接头序列 + 酶切位点序列 + 2 3 个随机核苷酸（ 翁跃进， 1996）。 随着 序技术的发展，在植物病害研究中常以核糖体 的转录间隔区（ 基因间隔