【毕业学位论文】（Word原稿）偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价及中间偃麦草Na+H+逆向转运蛋白基因的克隆草业科学毕业论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价及中间偃麦草 H+逆向转运蛋白基因的克隆 of a a+/H+ of a a+/H+ I 摘 要 盐胁迫是全世界范围内影响作物产量的最严重的非生物胁迫之一。利用基因工程提高植物的耐盐性，培育出能适合在盐渍化土地上生长的植物品种是有效利用盐渍化土地的主要方法。 指标筛选与综合评价 是牧草耐盐性育种的前提。 偃麦草属 (植物是优质的栽培牧草，也是小麦的野生 近缘种， 在小麦的遗传改良中具有十分重要的利用价值 。 本实验对引自 国外 的 21 份野生偃麦草属种质资源材料，在不同盐分梯度胁迫下 ，研究了苗期生长、渗透调节、叶片 K+含量、细胞膜伤害、叶片光合指标与植物耐盐性的关系；进行了苗 期耐盐性 指标筛选与 综合评价，克隆了 中间偃麦草 液泡膜 H+逆转运蛋白基因 ，并进行了生物信息学分析。研究结果如下： （ 1） 不同 度胁迫下偃麦草属牧草存活率随着浓度增高而降低，对照、盐浓度 迫下存活率都达到了 100%，盐浓度 迫下存活率在 63%100%，其中存活率都大于 50%；盐浓度 迫下存活率在 27%93%，其中存活率大于 50%的有15 份；盐浓度 迫下存活率在 10%73%，其中存活率大于 50%的只有 5 份，供试材料出现大量死亡。 综合评价值 D 和存活率耐 盐系数高度正相关，相关系数为 明 综合评价值 D 能较好地反映材料耐盐性的真实情况，在盐胁迫下偃麦草属牧草材料存活率越高其耐盐性就越强，反之存活率越低其耐盐性越差。 （ 2） 通过 21 份偃麦草属材料 存活率、株高、根茎比、生长胁迫指数和叶片伤害率的测定，利用主成分分析法和隶属函数法， 对 21 份偃麦草属材料 耐盐性 进行了 综合评价， 结果表明：材料 耐 盐 性 较 强 ， 材 料盐性较差 ，其余材料耐盐性居 于中间 。 （ 3） 选取 10 份 材料 ，在 不同梯度 迫下，通过 存活率、 K+/丙二醛含量、 脯氨酸含量 等 12 项与植物耐盐性相关指标的测定，利用 相关分析、 主成分分析、 隶属函数法和通径分析， 进行了 偃麦草属植物苗期耐盐性指标筛选及综合评价的研究 。结果表明： 存活率、 K+/丙二醛含量、脯氨酸含量、生长胁迫指数、相对生长速度 6 个 指标 可以对偃麦草属植物耐盐性进行 综合评价 ； 10 个材料的耐盐性预测值（ 耐盐综合评价值（ D）极显著相关。 （ 4） 盐胁迫下 ，偃麦草属材料叶片游离脯氨酸、可溶性糖含量逐渐积累，增强了其渗透调节能 力；低浓度胁迫下，叶片拒 力较弱， 量急剧增加， K+含量下降迅速，叶片伤害率与丙二醛含量逐渐增加，随着盐浓度增大， 离子泵被活化，叶片 拒 力 增强，量增加与 K+下降较为缓慢， 细胞膜伤害较 为 严重 ，伤害率迅速增加， 幼苗生长衰弱，自身保护能力下降， 丙二醛含量 随之下降 ； 盐胁迫下叶绿素含量、叶片蒸腾速率逐渐下降，叶片净光合速率 下降 主要是由于叶肉光合细胞活性受到抑制而引起的； 随着盐浓度的升高， 植株生长受到抑制， 所有材料的株高、分蘖数、 总 生物量、存活率显著降低 。 （ 5） 根据小麦液泡膜 H+逆转运蛋白 基因 全长序列设计引物，通过 接扩增的方法从中间偃麦草（ 克隆到了 同源基因，命名为 。 大开放阅读框为 1641 码 含有 546 个氨基酸残基、分子量为 59.8 蛋白 ， 预测等电点 有 38个碱性氨基酸， 36 个酸性氨基酸， 256 个疏水氨基酸 及 129 个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约 44%的 21%的 4%的 9%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示 ， 有 12 个连续的疏水片断，其中 10 个可能构成穿膜螺旋。 序列分析显示 ， 小麦 (长穗偃麦草 (水稻(小盐芥 (拟南芥 (植物的液泡膜 H+逆向转运蛋白高度同源，序列相似性分别为 97%、 96%、 85%、 68%、 67%。 序列比对结果以及进化树分析均表 明 为定位于中间偃麦草液胞膜上的 H+逆向转运蛋白。 关键词： 偃麦草属；耐盐性；苗期；综合评价 ； H+逆向 转运蛋白 基因 ； 生物信息学 is of of in To a of of is of It is in of 12 at by a+/H+ of as (1) 00% 3% 00%， 27% 3%,67 of s (2) 5 at 1 by 88,(3) 6 +/ P (4) a+ + DA (5) a a+/H+ to 641bp in a 46 of of 8 36 256 29 4% 21% 4% 9% 0 a H+ V 目 录 摘 要 . I . 一章 前言 . 1 分胁迫对植物的伤害 . 1 物的耐盐机制 . 2 草耐盐鉴定指标研究进展 . 4 物抗逆性综合评价方法研究进展 . 7 a+/H+逆向转运蛋白及其与植物耐盐性的关系 . 8 麦草属牧草相关研究 . 9 第二章 21 份偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价 . 10 料与方法 . 10 验材料 . 10 验处理与方法 . 11 据处理 . 11 果与分析 . 12 胁迫下偃麦草属牧草存活率的变化 . 12 项指标的耐盐系数 . 12 1 份种质材料苗期耐盐性综合评价 . 13 论 . 15 结 . 16 第三章 偃麦草属植物苗期耐盐性指标筛选及综合评价 . 17 料与方法 . 17 验材料 . 17 验材料处理 . 17 验指标测定 . 18 据处理 . 19 果与分析 . 19 项指标的耐盐系数及简单相关分析 . 19 用主成分分析筛选综合评价指标 . 20 麦草属牧草苗期耐盐性综合评价 . 21 合评价值与各指标的回归分析 . 22 2 个指标对耐盐性综合评价值（ D）的通径分析 . 23 论 . 24 麦草属牧草苗期耐盐性评价指标的选用 . 24 麦草属牧草苗期耐盐性综合评价 . 24 麦草属牧草耐盐性综合评价值 D 与存活率的关系 . 24 结 . 25 第四章 盐胁迫下中间偃麦草的生理响应及生长研究 . 26 料与方法 . 26 验材料 . 26 验材料的处理 . 26 验指标的测定 . 26 验结果与分析 . 26 间偃麦草渗透调节与耐盐性关系 . 26 麦草 K+、 量与耐盐性关系 . 28 间偃麦草细胞膜伤害与耐盐性关系 . 29 麦草耐盐性与叶片光合相关指标的关系 . 30 麦草耐盐性与苗期生长的关系 . 32 论 . 35 胁迫下植物叶片游离脯氨酸积累 . 35 胁迫下植物叶片膜质过氧化产物丙二醛的积累 . 35 胁迫下植物叶片净光合速率和蒸腾速率的变化 . 35 胁迫下叶片 K+ 、 K+/化 . 36 结 . 36 第五章 中间偃麦草 H+逆向转运蛋白的分子克隆及其生物信息学分析 . 37 验材料与方法 . 37 验材料 . 37 验方法 . 38 基酸与蛋白质生物信息学分析 . 42 果与分析 . 43 提取 . 43 间偃麦草液泡膜 H+逆向转运蛋白基因的克隆 . 43 因序列特征分析 . 44 源比对与系统树构建 . 46 论 . 48 结 . 49 第六章 全文结论 . 50 参考文献 . 51 致 谢 . 58 作者简历 . 59中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前言 分胁迫对植物的伤害 分胁迫对植物伤害的主要表现 盐分胁迫对植物的伤害主要表现为生长抑制、光合下降和加速衰老。生长抑制是植物对盐渍响应最敏感的生理过程 。 植物被转移到盐逆境中几分钟后，生长速率 即有所下降，其下降程度与根际渗透压呈正比。另外，当植物受到环境胁迫时，往往会发生光抑制现象，光抑制现象的主要发生部位为 于盐胁迫对 尚未得到统一认识。 1993）认为，盐胁迫可以改善 1994）则认为 ， 盐胁迫可以抑制 众多实验研究表明，盐分胁迫对非盐生植物的光合作用是抑制的，并且降低程度与盐浓度呈正相关 。 另外，光合能力的下降也与植物种类或品种以及盐的种类有关 。 加速衰老是指在盐胁迫下植物细胞中积累盐分，促进细胞衰 老和死亡 。 盐分促进衰老的机理目前认为主要有以下三方面 ： 盐分对细胞膜和酶类的直接伤害 。 盐分对植物细胞膜的伤害，大家得出的结论是一致的，即随外界盐分浓度的增加，细胞膜透性增大 。 用等渗的证明盐分对细胞膜的伤害不仅是渗透效应，而且更主要的是离子效应 。 高浓度 使膜结合的离子中 +增大，膜结构完整性及膜功能改变，促进胞内K+， 磷和有机溶质外渗，细胞内 K+/降 ，而外源 显缓解了上述 萍 ， 1996） ； 活性氧伤害 。 在生物体中，尤以植物细胞中的氧浓度最高，这主要是由于植物体中在叶绿体和线粒体光合电子传递链中泄露的电子可以与 2-， 在光照下，叶绿素分子可将其激发能传递给 02而生成 02 （ 1984； 1994），盐胁迫下，植物的光能利用率和 进了活性氧的生成和脂质过氧化，并对蛋白质和核酸等造成损伤 ； 渗透效应 。 当外界盐分浓度大于植物细胞内积累的盐分浓度时，将 导致细胞内的水势增高，使细胞失水，加速衰老进程 。 分对植物伤害假说 土壤盐渍化抑制植物生长的机理学术界存在两种观点：一是渗透效应，二是离子毒害效应。究竟哪个占主导目前仍有争议（陈德明 ， 1994）。 J. 1980）提出盐对植物的胁迫可分为渗透胁迫、离子毒害、离子不平衡或营养缺乏三类。 土壤溶液中可溶性盐含量的增加将导致溶液渗透压增大，引起植物发生生理干旱，从而抑制植物正常生长。干旱或半干旱地区的干旱季节，大量的地表蒸发使土壤溶液不断浓缩，促使盐分离子进入植株体内并积累，同时还发生离 子拮抗，阻碍或破坏了正常的生理代谢，致使植物畸形或死亡（陈德明 1994） 。 植物耐盐性是多基因控制的复合遗传性状 (997)。盐胁迫的两个基本组成部分是渗透胁迫和离子效应。 986)在总结前人研究的基础上提出了新的盐害假说，认为 ： (1)新叶生长速率减慢是植物对盐渍响应最敏感的生理过程，当植物被转移到盐渍中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 2 环境中几分钟后，生长速率即有所受到影响，生长速率减慢的程度与根际渗透压呈正比( 1982)。根系感受盐胁迫，通过木质部向地上部分传递胁迫信息。其信使 可能是植物激索； (2)叶片含盐量过高是老叶死亡的主要原因 ： 盐渍条件下，不能排盐的植物由于蒸腾作用，叶片上盐分不断积累，导致叶片慢慢死亡。叶片死亡的时间主要取决于根际的盐浓度、根系拒盐能力以及影响蒸腾速率的环境条件 ； (3)碳水化合物枯竭，不能满足生长和代谢的需要，导致植物死亡。当老叶死亡速率大 于 新叶生长速率时，单株叶面积下降，贮存的碳水化合物越来越少，不能满足生长和代谢活动的需要，植株死亡。因此，提高植物耐盐性的基本原则是 ： 增加新叶生长速率 ， 提高叶片耐盐阈值 ， 降低地上部分盐浓度 ， 增加叶片光合效率。 以上这两个 盐害假说分别从细胞水平和整个植株水平说明了植物对盐胁迫的响应，系统地解释了盐分对植物的伤害问题。 物的耐盐机制 物形态学耐盐适应机制 植物在盐环境中长期生存时，盐环境常诱导其形态、结构发生变化。主要表现：叶高度退化，叶片数或叶面积减少，单位叶面积气孔数减少，气孔多下陷；叶片增厚多汁液，下皮层有较厚的栅栏组织起贮水作用； 1985）、 1989）和 牛菊兰 （ 1994）认为叶表皮细胞排列紧密，叶表皮变肥厚，叶表面蜡质化。 1991）得出 根量增多，有根套或沙套，根的内皮层细胞木栓化，形成独特的通气组织（ et 1992） 。输导组织的形成受阻和发育推迟，维管组织比例小（ et 1991） 。 物生理学耐盐适应机制 物对细胞内离子相对平衡的调节 盐碱化土壤上的植物往往受到 毒害和 亏缺的双重伤害（ et 1994） 。许多研究表明 （ 侯振安 ， 2001； 李品芳 ， 2001） ，植物的耐盐性与植株地上部对 积累的限制力及高 K 比例的保持能力有关，植株 地上部 K 比率高者耐盐性强。过量的 对植物有多种毒害作用，如影响 吸收而使叶片细胞膜的正常透性破坏。使 K 向外渗漏（ 严顺国 ， 1995）；叶片中过高的 破坏类囊体上光合系统组成的结构从而降低植物光合速率；叶片中过多的 会抑制韧皮部中固化产物的运输而使叶片生长缓慢 （ 1994） 。因此，植物以高效的离子运输和选择性吸收机制，通过对离子的选择性吸收、外排和区域化来维持细胞内的生理代谢达到动态平衡，表现出植物的不同程度的耐盐性，这种平衡一旦受到破坏，就表现为盐胁迫而使植物受伤害。离 子的转运吸收以及外排和区域化是由植物本身与之相关联的生理生化过程共同完成的（ et 1994） 。 物细胞的渗透调节作用 许多研究表明细胞渗透势的改变源自细胞内溶质含量的变化（ 1993； 翁 森红，1992）。 引起细胞内溶质含量的变化的物质一是从外界环境中吸收的无机离子，二是在细胞内中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 3 合成的小分子有机物，两者对渗透调节的贡献率随植物品种的不同、生境的不同而有所不同。植物细胞原生质中的多种酶对无机离子浓度较敏感，有一定浓度的离子抑制某些酶的活性（ 王萍 ， 1998）。因此，许多盐生植物将吸收的盐分离子 贮存 在液泡内。而细胞在受到渗透胁迫时，细胞内积累渗透调节物质，主要是一些对酶的正常功能没有影响的有机化合物，且种类有限，最常见的有游离脯氨酸（ 刘华 ， 1997）。 代谢反应 盐胁迫下过量无机离子的进入干扰了细胞内正常 其是多胺和氨基酸的生物合成被明显激活（ 高辉远 ， 1994）。盐胁迫下，植物细胞内的天门冬酰胺，谷酰胺和缬氨酸、脯氨酸等氮代谢产物会增加，并且具有渗透调节作用。除此之外， 迫下，多胺（ 含量也会 ， 发生变化。赵福庚 （ 2000）对大麦幼苗在盐胁迫下多胺合成的研究表明： 理 2之对应的放射性 量随着 正相关趋势。小麦品种的耐盐力与精胺（ 亚精胺（ 含量及总 胺的比率呈正比（ 刘友良 ， 1987） 。多胺可以调节植物的生长发育，高含量的 起着稳定膜系统的作用；但 此植物的耐盐力与 量呈正比而与 量呈反比 （ 王锁民 ， 1994） 。 物细 胞耐盐适应机制 胞膜透性 许多研究表明，盐胁迫对植物产生伤害时，细胞的膜系统被破坏，膜透性增大，细胞质中的离子外渗。在麦类作物中耐盐品种比盐敏感品种细胞膜稳定性强（ 王瑛 ， 1999； 王萍 ，1994； 于卓 ， 1997）。王萍对羊草（ 苗进行研究表明，在 迫下，羊草幼苗生长受抑，叶片细胞膜相对透性增大。陈月艳（ 1997）对盐胁迫下的星星草种子的萌发及膜透性的研究表明，盐胁迫对种子从干燥不完整的膜系统在吸水修复过程中有所影响，种子膜系统 的修复能力随着盐浓度增加而降低。在 胞膜及内膜系统修复受阻。这说明在盐胁迫下膜修复受阻是抑制植物种子萌发的重要原因之一。 脂过氧化及保护酶系活性 盐胁迫对质膜的伤害作用被认为是盐对植物的原初直接伤害作用（赵可夫， 1993）。目前，以 量的研究表明，在逆境下植物体内活性氧代谢平衡被破坏，过剩的活性氧会引发或加剧膜脂过氧化作用，造成膜系统的严重伤害。耐盐性较强的植物能借助体内活性氧清除系统有效地清除逆境诱导的活性氧（龚明， 1989；陈少裕， 1991；王建华， 1989）。植物为了保护自己免受活性氧的伤害，在植物体内有两大类物质能阻止膜脂过氧化过程：一类为保护酶类，主要有超氧化物歧化酶（ 过氧化氢酶（ 过氧化物酶（ ，另一类是抗氧化性物质，主要有类胡萝卜素（ 还原型谷胱甘肽（ 。它们共同作用来维护体内活性氧代谢的平衡。龚明等（ 1989）对中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 前言 4 大麦和小麦不同品种的耐盐性进行研究表明，耐盐的大麦品种比不耐盐的小麦品种更能维持相对较高的 活性，从而削弱膜脂过氧化作用 ， 减轻膜的伤害。刘志生（ 1996）对小麦品种的耐盐性研究的结果也与之一致。 导蛋白的产生 植物适应逆境胁迫，另外还有一种策略是大量合成多种胁迫诱导蛋白（ 比较盐适应与非盐适应的烟草细胞的蛋白质图谱，发现适应含 种含羟脯氨酸的 20262中 2626白是盐适应细胞中特有的，由于它的合成总是伴随渗透调节， 因此被命名为盐适应细胞中它的含量随环境水势下降而升高，甚至可达到总 细胞蛋白量的 12。1987）用 200理大麦品种 2） 幼苗后，发现其根中有许多种蛋白质的量都比对照植株中的量增多，其中有两种蛋白质的量增加最明显。以上研究结果表明，盐胁迫不仅会诱导植物合成新蛋白和改变蛋白质的量，而且新合成的蛋白质及改变的蛋白质与植物的耐盐性有关，但其作用机理有待于进一步研究。 草耐盐鉴定指标研究进展 草种子萌发指标 1983， 1984）用发芽百分数、叶片长度、胚芽干 /鲜重和 发芽率作为耐盐选择的标准，认为在盐胁迫下，草地早熟禾种子的总发芽数与发芽天数、叶片长度和叶片重量的相关系数分别为 此建议用叶片长度赖评价抗盐力的大小。 1993）发现高盐度下，野牛草种子发芽率与幼苗成活率相关达 此认为高盐条件下可用发芽率作为鉴定抗盐力的标准。 翁森红（ 1992）对几种牧草进行耐盐性试验表明：牧草种子发芽率随培养液盐分浓度的增高而降低，且盐分浓度越高幼苗成活率越低。 李潮流（ 2004）用两种盐胁迫 6种多叶型苜蓿，测定种子的发芽势、发芽率、胚芽长、胚 根长、根芽比及全株重等指标，表