【毕业学位论文】（Word原稿）表达绿荧光蛋白的重组马立克氏病病毒814株的构建预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 表达绿荧光蛋白的重组马立克氏病病毒 814 株的构建 F 14 F 14 I 摘 要 鸡马立克氏病（ s 由马立克氏病病毒（ s 起的鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生 性疾病。 它作为载体构建表达外源抗原的多价活疫苗来诱导免疫，可达到预防一种或多种禽病的目的。 （ 814株是我国分离到的自然弱毒株，长期作为疫苗使用，免疫原性良好。选择其作为病毒载体构建重组病毒，可用于 时也可利用其研究 本文利用 14疫苗株作为载体，以病毒基因组 别插入绿荧光蛋白（ 因表达盒、新城疫病 毒（ 合蛋白（ F）基因表达盒和禽流感病毒（ 凝素（ A）基因表达盒，分别构建了包含 基因、 时获得了一株表达 14株重组病毒。 根据 计两对引物，并于各引物 5端引入酶切位点，以 14株基因组 板进行 源臂 1的上游引物在 游引物在 近起始密码子；同源臂 2的上游引物在 近终止密码子，下游引物在 两 次克隆入 建成重组 过与 实获得的 14株同源臂序列与预期相符合。 根据商品化表达质粒 其启动子上游及 引物 5端 分别引入酶切位点，以质粒载体 得 中包含 此基因表达盒克隆入载体质粒 得包含 根据质粒 含 基因表达盒）和 含 苷酸序列分别设计一对引物， 和 克隆入质粒 得 转移质粒载体 采用磷酸钙沉淀法，将 14株基因组总 经绿色荧光标记筛选，获得表达绿色荧光蛋白的重组 14病毒。 14株 组病毒在 0代后， 明重组病毒能够在体外稳定遗传。通过测定重组病毒和 亲本 病毒的体外生长曲线，证明重组病毒的生 长特性与亲本病毒无显著差异。 本实验成功构建了表达绿色荧光蛋白的重组 14株，为 我国 时还构建了包含 基因的重组转移载体质粒，在此基础上，可以通过反向筛选的方法获得表达 蛋白的重组 814病毒。 A 白和 蛋白都是抗原性非常好的蛋白，用它们构建重组 14株，可以很好的诱导机体的体液免疫，从而达到同时预防几种禽病的目的。 关键词 马立克氏病病毒 绿荧光蛋白基因 重组病毒 s is a of s is a of it to of or (14 is a as in We it as to is to D DV (14 as be D be to DV D. ) A) 14 to of A DV 14 FP to of A 2 of to CR of at S1 at of at at a of CR in to DV of 14 is of A. on of a of a of FP CR at of of CR MV FP FP of DV FP of A to IV of NA of DV DV 14 NA DV 14 FP CR FP 14 0 FP be in of of in of so DV 14 FP is D DV We A a DV 14 A A in we of or s HA F V 目 录 第一章 绪论 . 1 立克氏病病毒简介 . 1 立克氏病病毒的形态学特征 . 1 立克氏病病毒的分类及血清型 . 2 立克氏病病毒基因组 . 3 立克氏病病毒基因组结构 . 3 立克氏病病毒致肿瘤相关基因 . 5 毒基因组中的复制非必需区 . 6 立克氏病病毒的致病机理 . 7 立克氏病的疫苗研究 . 8 规疫苗 . 8 因工程疫苗 . 10 立克氏病血清型 病毒作为疫苗载体的研究 . 12 立克氏病血清型病毒作为活疫苗载体的可能性 . 12 动子的选择 . 12 告基因的选择 . 12 源基因插入位点的选择 . 13 染方法的选择 . 14 于构建 重组病毒的其它禽病基因 . 15 研究的目的及意义 . 16 第二章 包含外源基因的马立克氏病病毒 814株转移载体的构建及表达绿荧光蛋白的重组 814 株的建立 . 17 料与方法 . 17 毒株、细胞及细胞培养用试剂 . 17 粒、细菌载体及分子克隆方法 . 17 化试剂及试剂盒 . 17 主要仪器设备 . 17 胚成纤维细胞的制备 . 18 毒基因组总 取 . 18 物设计及合成 . 18 增 . 19 肠杆菌感受态细胞的制备 . 20 移载体质粒的构建及鉴定 . 20 毒基因组与转移质粒载体的共转染及重组病毒的筛选与纯化 . 21 组病毒的鉴定 . 22 组病毒体外生长特性测定 . 23 果 . 23 染 因组总 提取 . 23 源臂及基因表达盒 增结果 . 24 组转移载体质粒的鉴定 . 25 组病毒的筛选及纯化 . 32 组病毒的鉴定 . 32 组病毒体外生长特性 . 34 论 . 35 第三章 全文结论 . 37 参考文献 . 38 附 录 . 47 致 谢 . 52 作者简介 . 53 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 菌人工染色体 bp 基对 胚成纤维细胞 细胞病毒 氧核糖核酸 氧核昔三磷酸 g 色荧光蛋白 hr 时 of 鸡疱疹病毒 L 菌培养基 s 立克氏病 s 立克氏病病毒 mg 克 钟 mL 升 mm 米 摩尔浓度 尔浓度 合酶链氏反应 s 组马立克氏病病毒 /转 特定病原体 0 短独特区 10 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 1 第一章 绪论 鸡马立克氏病（ s 由鸡马立克氏病病毒（ s 起鸡的一种以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征的恶性肿瘤性疾病（ 1967； 1968），导致鸡产蛋率下降、免疫抑制引起进行性衰竭进而死亡。该病毒主要感染鸡的外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤，发生单核细胞浸润，进而引起许多功能障碍，主要表现在： 1）在淋巴系统生成淋巴瘤和导致免疫抑制； 2）在神经系统引起外周和中枢神经的疾病；3）在心血管系统出现动脉粥样硬化性损伤； 4）引起上皮损伤，形成羽毛囊结（ 001）。 养禽业造成了非常大的经济损失。据估计， 0亿 2004）。该病虽经 疫苗控制，但随着强毒力毒株的出现其流行及危害呈逐年上升的趋势。 着病毒毒力增强，病毒宿主范围的扩大，本病也可以危害鹌鹑和火鸡等。 997年报道了九十代初在法国南部火鸡因 0%； 1996年 鸡场相邻的二个暴发 2%和 因此必须加强对该病的防治工作。 随着 有的 D，迫切需要新型疫苗防制 2000年后，对 毒 特异性蛋白结构与功能等方面的研究取得了突破性进展。利用同源重组等方法构建重组病毒技术的日渐成熟，以 时也为发展高免疫原性病毒作为传递免疫调节分子或保护性免疫原的病毒表达载体提供机遇。 肿瘤生物学研究方面具有重要意义。 1983； 1984），对人体无危害，是研究肿瘤形成的机理良好的模型（ 殷震等， 1997）。该病的深入研究，不仅是养禽业发展的需要，而且还有助于研究病毒的致瘤机理及肿瘤的预防和控制，在比较医学上也有较大意义。 立克氏病病毒简介 立克氏病病毒 的形态学特征 种是裸病毒，一种是有囊膜病毒。前者具有严格的细胞结合性，后者是非细胞结合性的，可脱离细胞而存活。 四种成分组成，即核芯（ 核衣壳（ 被膜（ 囊膜（ 病毒 ， 核衣壳呈二十面体对称，由 162个衣壳 粒 构成 。壳粒呈柱状，大小为6相邻衣壳粒中心间距 末端固定于衣壳的内侧。在 电镜下观察 感染细胞 ， 可见 85偶尔也能见到150囊膜病毒粒子，它们主要结合于核膜或 核内空泡膜。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 2 立克氏病病毒的分类及血清型 根据免疫扩散试验（ 免疫荧光试验（ 清型病毒（ 括所有致病的和致弱的 病毒株致病和致 瘤的潜在性差异很大；血清型病毒（ 天然不致病的 清型病毒（ 火鸡疱疹病毒（ of 对鸡没有致病性。单克隆抗体技术的应用进一步确定三个血清型病毒之间的血清学差异（ 1979； 1983；1991），这 3种血清型病毒之间也存在血清学交叉反应（ 1975）。 据 种病原型，即几乎无致病性或致瘤性的温和型 （ s 强毒型（ s 超强毒型（ s 特超强毒型（ s 1983）。 2004年国际病毒分类委员会发表的第 8次分类报告中，将 疱疹病毒亚科，马立克氏病病毒属（表 1）。 表 1 疱疹病毒的 最新系统分类 of 疹病毒科（ 感 染 脊 椎 动 物 疱疹病毒亚科 单纯疱疹病毒属 （ 人疱疹病毒 1 型 （ ） 单纯疱疹病毒 1 型 （ ） 巨足类疱疹病毒 （ 水痘病毒属 （ 人疱疹病毒 3 型 （ ） 水痘 （ 牛疱疹病毒 （ 马疱疹病毒 （ 伪狂犬病病毒 （ 马立克病毒属 （ 、型马立克氏病毒 （ 火鸡疱疹病毒 （ of 传染性喉气管炎病毒属 （ 禽疱疹病毒 1 型 （ ） 疱疹病毒亚科 巨细胞病毒属 （ 人疱疹病毒 5 型 （ ） 巨细胞病毒 1 型 （ ） 鼠巨细胞病毒属 （ 鼠巨细胞病毒 1 型 （ ） 玫瑰疹病毒属 （ 人疱疹病毒 6 型 （ ） 疱疹病毒亚科 淋巴潜隐病毒属 （ 人疱疹病毒 4 型 （ ） 毒 （ 细长病毒属 （ 松鼠猴疱疹病毒 2 型 （ ） 鼬疱疹病毒 （ ） 鱼回鱼疱疹病毒属 （ 鱼回鱼疱疹病毒 1 型 （ ） 参考文献：（ 徐耀先 ， 1999； 方忠意， 2005） 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 3 立克氏病病毒基因组 立克氏病病毒基因组结构 含有一个独特长区（ 一个独特短区（ R）。其基因组 模式为： 特长区末端重复序列） 特长区内部重复序列） 特短区内部重复序列） 特短区末端重复序列）（图 1 已建立的 1984； 992； 1987）显示，3种血清型病毒基因组 子杂交结果表明，在非严谨杂交条件下， 在严谨条件下，其同源性下降至 5%。 图 1 3 种血清型 因组的结构模式图 (制 ) of DV 已经测定的部分毒株的全基因组序列来看， 60中 7874786460 2000； 2001；2004； 2007）。 根据 2001；2001； 2000； 2000； 2004； 2001），推测 00多个基因（ 2006）， 7个开放阅读框架（ 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 4 2个，病毒基因组至少可以编码 80种蛋白，其中大部分为三种血清型病毒所共有，并且在单纯疱疹病毒（ 可以 找到类似物。在 1975； 2006； 004），而这些基因对于 9个基因间有差异（ 2007）。 瘤相关基因包括 132因和 蛋白基因包括 它基因即除上述两类基因外的基因， 如 2、 4、 引自 2006 图 2 因组结构模式图 he DV 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 5 立克氏病病毒致肿瘤相关基因 类，即直接相关基因 有辅助作用的基因为病毒编码的端粒 间接相关基因如 13238蛋白复合体）基因、 毒脂肪酶（ 2006）。其中 32 1. 直接相关基因 因的启动子区域含有类似于热休克因子（ 列。 39个氨基酸残基组成， 该结构域与 1997； 2002； 2005； 2006）。 2006） 。此外， 些都提示该蛋白在 同致病型 ，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高，在 间。韦平等发现 14株的起始序列有 3个连续碱基的缺失，可据此设计特异性引物通过聚合酶链式反应（ 法扩增 据不同的扩增结果来区别疫苗株和强毒株。 类是含 15个氨基酸残基（ 结构，有 2个重复，另一类是含 6个氨基酸残基（ 结构，有4个重复，它们全部分布在 端富含脯氨酸的转录激活域内。 有很高的表达活性， 随着感染后时间的增加，具有从核质向核仁和核膜转移的趋向。 132个 组 132别对应于基因组 于 于 该重复序列与病毒的致癌性密切相关。这一区域含有 3个外 显子的基因簇，可形成 5种不同信息。 132致瘤性很强的 鸡胚成纤维细胞（ 连续传代培养后，随着病毒毒力的减弱，重复数增多，最多可增至 30多个。但也有例外， 14株为弱毒株，其基因组 132个。 2007）将 拷贝 132亲本病毒以相同方式接种，发现此缺失株病毒仍可以作为病原感染动物，而且具有与亲本病毒 相似的症状；在细胞上传代同样可以致弱缺失株病毒，猜测病毒致病机理可能与 1322007）。 而提高肿瘤发生率。 ，位于 大小 为 772 此推中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 6 测其可能与致肿瘤有关。 二聚体，导致活性丧失，使靶细胞无任何应答，从而使 利于病毒在体内的潜伏与感染。应用杆状病毒表达的 到免疫逃避的目的。感染与感染 能够诱发肿瘤，但发生肿瘤的鸡比感染 明 细胞转化过程中是非必需的。而 细胞感染较弱，接种后 4周时大部分病毒从感染鸡体内被清除掉，说明 近发现的 能与 说明 淋巴细胞，进一步促进 3种血清型中是保守的（ 2000； 2000； 2001； 2001； 2001）。 的缺失导致感染病毒后的早期外周血液中病毒滴度的下降，继而降低肿瘤发生率。 可以影响病毒在体内的复制，但不是转化 此 2005）将细菌人工染色体 现此缺失 仅缺失 3辅助作用基因 肿瘤的生成不仅要求细胞的本质发生变化，细胞还要逃避衰老和程序性死亡。端粒末端转移酶是一种与细胞存亡相关的酶，它包含两个核心成分，一个蛋白亚基称作反转录端粒末 端转移酶（ 一个 它是 拷贝的 R（ 源性为 88。 少 肿瘤发生，肿瘤大小和扩散方面都大为减弱。这强有 力的说明了 和端粒末端转移酶的失调在淋巴瘤的生成和转移灶形成中的作用。 而诱导独特的检查反应，引起突变体 毒基因组中的复制非必需区 目前对 对强毒株和弱毒疫苗株之间基因序列的差异也有了深入的了解（ 2006； 2007）。在病毒基因组中约有 20%的非必需区（ 可插入约 10000片段。这些部位的缺失