【毕业学位论文】（Word原稿）大豆WRKY转录因子基因的分离及其功能分析生物化学与分子生物学博士论文

密级：内部 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 大豆 录因子基因的分离及其功能分析 I 摘 要 一类近年来发现的转录调控因子，在高等植物中构成一个基因超家族，它不但 广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应，还参与了生长发育及多种代谢途径的调控，在植物的整个生命周期中起着重要的作用。 大豆（ 一种重要的高蛋白油料作物和 固氮植物，为人类提供了丰富的 蛋白质和营养物质来源， 因其适应性广，营养丰富，用途广泛而受到普遍的重视，是我国的重要经济作物。 本研究利用酵母单杂交系统从大豆 库中分离了四个 基因： 对其功能进行了初步研究，主要结果如下： 1、采用酵母单杂交系统对大豆 库进行了筛选，共得到 4 个不同的克隆，分别命名为 列分析表明 属于 转录因子，具有典型的 构域。 于 组， 于第组。 长编码序列 1080码 359 个氨基酸，与葡萄的 列相似性为 长 编 码 序 列 849 编 码 282 个 氨 基 酸 ， 与 序列相似性为 长编码序列 900码 299 个氨基酸，与烟草的 列相似性为 长编码序列 921码 306 个氨基酸， 列相似性为 48%。 2、 大豆的根、茎、叶中均有表达，但四个基因在大豆中表达丰度不一， 表达较强， 之， 较弱 。 3、 酵母体内均能与 合，而不能与 合；在 E. 表达了 白， 验表明 体外具有 合特异性，而与 不能结合； 酵母细胞中具有转录激活功能。 4、 合的表达，表明 定位在细胞核内。 5、 因在拟南芥中的过表达没有影响拟南芥植株的正常生长发育，且 ，盐等非生物逆境的抗性，对 P. 抗性也有提高。 6、 因在烟草中的过表达可以提高植株对高糖胁迫下的耐性，但在高盐（ 高渗（ 件下则未观察到 差异。 关键词： 大豆；转录因子； 境 a in in as to in a of is an It is as an it is of of In 1. by as , . DS 08084990092159282299306 1%, 8%. 2. at in of 3. a as to in in in of to of in 4. on of FP in in 5. in in of to as as as to . 6. in of 录 摘 要 . I . 录 . 文缩略表 . 一章 绪 论 . 1 究目的和意义 . 1 内外研究现状 . 1 物转录因子研究进展 . 1 录因子的研究进展 . 9 究内容和技术路线 . 18 第二章 因的分离及其体内表达特异性分析 . 20 料与方法 . 20 料 . 20 法 . 20 果 . 22 豆 库的筛选 . 22 序列分析 . 24 大豆体内的表达特异性分析 . 31 论 . 31 结 . 33 第三章 结合特异性及转录激活分析 . 34 料与方法 . 34 料 . 34 法 . 34 结果 . 36 件的酵母体内结合特异性分析 . 36 件的体外结合特异性分析 . 38 酵母细胞中的转录激活功能分析 . 41 论 . 42 结 . 43 第四章 . 44 V 料与方法 . 44 料 . 44 法 . 45 果 . 52 合蛋白表达载体构建及其 察 . 52 生理功能分析 . 55 论 . 62 录因子的核定位信号 . 62 转录因子调控非生物逆境及其信号转导 . 63 转录因子调控抗病反应及其信号转导 . 63 结 . 65 第五章 结论 . 66 参考文献 . 67 致 谢 . 73 作者简历 . 74 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 统获得抗性 导系统抗性 定位信号 烯响应元件结合因子 表达子 胶电泳迁移分析 体类蛋白 激酶 响应元件 病原菌相关基因 促细胞分裂原蛋白激酶 杨酸 转录 国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 究目的和意义 录因子是近年来在植物中发现的一大类调控基因，在高等植物中构成一个基因超家族 (如拟南芥中有 74个成员 (et 2003)，水稻中有 100余个成员 (et 2005; J & 2005)。 能复杂多样的调控基因： 、盐等非生物逆境的应答及其信号转导 ； 态建成以及代谢调控。 但在水杨酸介导的系统获得抗性（ 重要作用，在茉莉酸介导的诱导系统抗性（ 生中也起重要调控作用，是水杨酸、乙烯和茉莉酸介 导的抗病信号传导途径的关键因子，是这些信号传导途径的关键交叉点和平衡点。 大豆（ 一种重要的高蛋白油料作物和固氮植物，为人类提供了丰富的蛋白质和营养物质来源。自 2001年以来，中国每年均需要进口大豆 1000万吨以上， 2004年进口大豆总量高达 2023万吨， 2005年 2659万吨。因此，发展大豆生产，培育具有优良性状的大豆新品种成为我国大豆产业的主要任务之一。已证实有 30多种大豆病害直接对生产造成损失，平均每年因病害导致的减产为 10%左右。这些病害包括由真菌、细菌、病毒、线虫等，危害大 豆的根、茎叶、豆荚、豆粒或整个植株。干旱、低温等非生物逆境也严重影响大豆的产量，平均每年导致的减产为 8左右 。因此培育抗病、抗逆的大豆新品种是提高我国大豆产量的有效措施。 综上所述，本研究的目的是分离大豆中与调控基因 一步阐明其功能，为我国今后大豆及其它作物的抗性育种提供基因源和理论依据。 内外研究现状 物转录因子研究进展 植物在长期的进化过程中，为了适应环境和满足各种生理需求，形成了复杂而精巧的调节机制。内外环境的变化作为信号被感知后，通过 一系列信号途径，引起相关基因的表达状态发生改变，最终赋予植物在生理上的适应性。 在众多的适应性机制中，基因表达的转录调节在植物应答环境信号刺激反应过程中起着重要的作用。转录因子是植物中最重要的一类调节基因。 转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的 过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。典型的植物转录因子具有 转录调控域 (激活域或抑制域 )、寡聚化位点 (核定位信号 ( 4个功能区域。 转录因子一般处于信号途径的中游，起承上启下的作用，上可接受被感知、加工放大的信号，下则通过与其它转录因子或辅助蛋白的相互作用结合特定基因的启动子元件，调控基因的表达；同时，可作为共同的信号转导组分位于几条信号的交汇点，参与信号转导途径的整合与对话。因中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 此，要从分子水平了解植物生长发育和适应外界环境的生理功能的机制，必须详细研究 各类转录因子在生物体内的功能。目前，转录因子功能的阐明已成为植物分子生物学的热点。随着模式植物和经济植物基因组测序的完成，如何运用遗传学和分子生物学方法鉴定这些转录因子功能显得越来越迫切和重要。与它们调控的目的基因不同，转录因子在染色体上出现重复 (产生大量冗余 ( 2000)；其本身的结构也较复杂，既有被调控或互作的结构域或基元 (如磷酸化位点、亮氨酸拉链 (螺旋一螺旋 (构，又有发生调控作用的结构域，如转录激活域和 /或抑制域 (et 1998)；另外，也是最重要的一点，转录因子功能研究离不开它们的目的基因，即如何寻找、确定特异的目的基因。这些特点决定了转录因子功能研究与一般的最终效应基因不同，具有其复杂性的一面。目前，通过遗传鉴定方法确定功能的转录因子仍在少数，拟南芥中 1533 个基因编码转录因子，占总基因数的 而遗传鉴定的只有 7%(et 1999; 1996)， 。 录因子的结构 合域 合域是指转录因子识别顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列。相同类型转录因子 合域的氨基酸序列较为保守，因此，这段氨基酸序列决定了转录因子的特异性。转录因子中其他氨基酸起到增强其结合的作用 (et 1996)。另外， 合域的二级结构也可能影响转录因子的结合的特异性，在这一过程中一些中性氨基酸残基，例如脯氨酸和甘氨酸更为重要 ( Y, 1997; Ni et 1996)。典型的植物转录因子 合域有 构域( J, 1991; S & P, 2002; et 2003)，锌指结构域 (H., 1998; et 2003)， et 1996; G et 2003; D et 1995)构域 (et 2003)， 构域 ( & J., 1997)等。 转录调控域 转录调控域包括转录激活域和转录抑制域两类，他们决定了转录因子功能的差异。同类转录因子的主要区别在于它们的转录调控域各不相同 ( & J, 1998)。转录因子的激活或抑制作用依赖于它对靶基因的转录起激活还是抑制作用。转录因子对靶基因的抑制作用可能是通过与其他转录因子竞争同一顺式调控元件进行的。除此之外，还可能存在诸如通过使转录因子二聚化而导致调控域被掩盖，转录抑制域与转录因子相互作用等机制 (et 1996)。 寡聚化位点 寡聚化位点是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守，大多与合域相连并形成一定的空间构象，如 转录因子的寡聚化位点包括 1 个拉链结构，而 b/转录因子含有螺旋 螺旋结构。 录因子的寡聚化域则形成两个 折叠。这些寡聚化位点空间构象的变化产生了转录机制的多样性，从而使转录因子具有调控高等植物基因表达的能力。许多高等植物的转录因子形成异聚或同聚物，以影响 合的特异性、转录因子对启动子元件的亲和 ( J & L, 1994; et 1992)和核的定位中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 ( B et 1997)。 核定位信号 核定位信号是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进入细胞核的过程受该区段控制 (1994; et 2000)。 ( et 2002)在研究55细胞中定位的分子机制时发现，核定位信号对 5细胞分布有决定作用。目前，已经在水稻的 et 1995)，玉米的 转录因子 1994)等多种转录因子中发现了核定位信号。不同植物转录因子核定位信号的序列、组织器官的分布和数量存在着差异。另外，不同转录因子的核定位信号的数目也不相同。有的转录因子只有一个核定位信号区，该类核定位信号区的碱性氨基酸或者聚集在一起或者形成两个被非保守氨基酸隔开的功能群 ( et 1997)。而有的转录因子具有多拷贝的核定位信号区，这些多拷贝的核定位信号区或者在功能上相互独立，或者成簇存在 (et 1996)。 一般情况下，转录因子的分类是根据保守的 合域进行的 (et 2000)。在植物中，转录因子分成几十种类型。 集了拟南芥所有转录因子 (1922 个位点； 2290 基因模式 )，总共分成了 64 个基因家族，表 出了一些常见的植物转录因子类型及其 合域的结构特征 ()。 录因子的功能 在转录水平上与 生相互作用的蛋白质分子中，最具多样性的便是转录因子，它们在高等植物的生长、发育、形态建成，以及生物和非生物胁迫等环境反应中起着重要的调控作用。 转录因子与植物生长发育和形态建成 高等植物的生 长发育和形态建成是一个非常复杂的过程。在这个过程中， 蛋白质起着主要作用，通过它们之间的互作，实现了对基因表达的调控。已经鉴定的转录因子如 和 广泛参与了植物的生长发育和形态建成。 近年来已经从玉米、拟南芥、金鱼草、水稻和棉花等多种植物中鉴定出了 转录因子( 2002)。 录因子家族含有保守的 构域，广泛参与植物发育、代谢的调节和植物激素的信号转导。王栋等研究了拟南芥根特异表达转录因子 果表明， 酵母中的过量表达导致染色体凝缩、细胞核不能正常分裂、胞质分裂不能进行、产生单核长细胞 (王栋 et 2001)。由于许多功能保守的植物基因在裂殖酵母中和植物细胞中具有相似的功能，因此可以推测植物 录因子可能与植物的细胞周期调控有关。植物 录因子另一个研究的较清楚的功能是控制细胞和植物的形态建成。编码 转录因子的 因，对拟南芥生物钟有调节作用。 光信号在转录和蛋白质水平的应答，暗示了 转录因子可能通过光信号而参与生物生理节律的调控 ( 2002)。 是另一类数量庞大的基因家族，在人、植物及酵母中均存在，估计在每种植物中 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 基因家族 (保守结构域 (基因家族功能 (拟南芥基因组中的数目 (20括 1 个 25 富含碱性氨基酸的区域和 1 个亮氨酸拉链 含有两个相连的基本亚区，其中碱性 与 合有关，螺旋一环一螺旋区参与二聚体形成 30基组成，含两个保守的 /或两个 56成，含有 1 个长 链 含有 1由 5成的呈螺旋 螺旋构象的不完全重复序列，每个重复含 3 个保守的 60 成 , N 端有保守的22含有 3 个平行的一折叠和 1个双亲性 由 350 成的类似 序列 ;有 , , ,四个基序 种子储存蛋白基因表达 ;光形态建成 ;叶发育 ;花发育 ;防卫反应 :物合成 花青素合成 ;光应答 ; 非生物胁迫 :花发育 花发育 ;开花时间 :种子 发育 ;根节发育 花发育 ;果发育 ;开花时间 ; 根发育 次生代谢 ;细胞形态建成 ;植物生长 :生物或非生物胁迫 :昼夜节律 生物或非生物胁迫反应 ;表皮毛发育、鞣质合成 ;糖代谢 ;种子休眠 :倍半萜烯合成 :体细胞胚发育 花器官建成 ; 叶缘细胞形成 ; 生物或非生物胁迫反应 生长素反应 ;参与光信号 72 127 134 104 150 74 146 29 表 物 中 主 要 的 转 录 因 子 家 族 of 国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 5 约有 25 30 种 基因 ( 1999)。该类基因的结构、表达，以及功能进化与植物花器官发生、花形态多样性的遗传机制和进化规律有密切的关系。对拟南芥 (, 1995)和牵牛花 ( G et 2003)的研究表明 ， 大多数 基因在植物发育中扮演多成角色。植物 基因除了调节花发育的作用外，还参与根、叶、果实、种子和胚胎的发育 (, 1995)。 转录因子与植物抗逆 高等植物中的胁迫诱导基因对植物抗逆有重要的作用。近年来，该类基因诱导信号的转导及基因产物调控作用的研究，已成为植物分子生物学研究领域的一个前言内容。 由于高等植物本身的复杂性，其胁迫诱导反应受多种信号途径的调控，并且不同胁迫反应的信号途径及其相关基因的表达调控上存在着交叉。 利用差示筛选法，从干旱处理的拟南芥中克隆了一批受干旱诱导的基因，并将其 定名为 to 因。其中 因的表达，不仅受干旱、高盐、低温胁迫的诱导，而且还受到外源激素 K, 1994)。 植物所特有的一类转录因子，据估计拟南芥中约有 124个该类转录因子，约占其转录因子总数的 8%。白具有一个 58 或 59 个保守氨基酸的区域，该区域能与两个顺式作用元件相结合：一个是，该元件存在于乙烯反应的 因的启动子中；另一类是 序，该基序与干旱、低温等非生物胁迫诱导的基因表达有关 (et 2002)。除此之外，与非生物胁迫有关的转录因子还有 ，该类转录因子具有保守的 别基序，与高等植物高温胁迫诱导基因的表达调控有关 (et 2001)。 另外，还有一些转录因子，它们与生物胁迫的抗性有密切关系，如 转录因子，以及录因子超家族等。 族成员之一 胁迫应答密切相关，对胁迫诱导剂引起调控作用 (et 2002)。 的研究表明该家族的转录因子与水杨酸信号转导途径的重要元件 互作用。当用水杨酸处理后，这种作用明显增强，与此同时特异的 合活性大大提高 ( X, 2002)。而 白除了与水杨酸信号转导有关，还能与 结合。 在于许多植物抗性基因的启动子中，与系统获得抗性有关（ et 000）。后面将详细论述 录因子。 究高等植物转录因子功能的方法 与功能基因的研究相比，有关转录因子功能研究和分析的报道要少的多，近年来也有了突飞猛进的发展。研究转录因子结构域的功能主要用到了 白融合技术等。研究转录因子生物学功能的方法主要有瞬间转化分析，突变分析，以及近年来发展起来的 扰技术 等。 转录因子结构域的功能研究方法 转录因子的功能域有 合域、转录激活或抑制域、核定位信号以及蛋白相互作用的寡聚化位点。如要研究转录因子的功能，一般先对这几个功能域进行研究。目前针对这些功能域的特点己发展了一些相应的体外和体内研究策略。 合域 基因的启动子区含有特异的转录因子识别与结合的顺式元件。通常情况下，鉴别一个转录因中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 6 子调控的启动子可以采取瞬时或稳定转化的方法，即将启动子序列与报告基因融合，将转录因子全序列或完整的编码区置于强启动子 5S 或 动子的控制下，共转化植物、悬浮细胞、原生质体或酵母细胞，然后测定报告基因的活性 ( M, 1998)。如果要定义出启动子的顺式元件，则可以运用凝胶电泳迁移分析 (方法。 研究 蛋白互作时应用最广、简单、快速、灵敏的技术。它可以用纯化的蛋白、细胞核或原核表达蛋白粗提物来检验蛋白与候选启动子元件结合的活性。基本原理是在非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白与标记的 件结合，形成蛋白 合物。这种复合物在凝胶中的泳动速度比较慢，标记的 现出相对滞后。运用 以鉴定转录因子的 et 1998)。一般是对转录因子的某几个氨基酸残基进行定点突变，确定合域中有关结合活性的关键氨基酸。通过这种方法，确定了水稻转录因子 责 个最小区域。这两个 合域分别与水稻光敏色素 A 基因启动子上的 Ni et 1996)。 以用来研究转录因子的共价修饰，或者研究微量的金属离子对合活性的影响。如，磷酸化的 白 强了与 件的亲和性 (et 1995)。用 子的鳌合剂 1， 10(1， 10理降低或完全抑制 et 1995)与顺式元件的结合。 转录调控域 确定一个转录因子是否具有转录激活功能，通常采用酵母单杂交体系。原理是，将该蛋白的编码序列 (确定是否有转录激活活性 )或可能的转录激活区 (确定转录激活域 )与酵母转录激活因子 合域融合， 转化酵母，观察转化子在选择培养基上的生长情况。这个方法很成熟，已经成功鉴定了不同物种的多种转录因子的转录激活域，如拟南芥的 合蛋白 米的 豆的 稻的 M, 1998)，以及烟草的 et 2001)。酵母单杂交法确定转录激活域的方法也存在其局限性：某些类型的激活域，如富含谷氨酰胺类在酵母中不起作用 (et 1995)。另外，它不能用来确定转录抑制域。抑制域的确定可以用另外的瞬时表达体系进行。 核定位信号 核定位信号域的鉴定通常采用与报告基因融合的瞬时或稳定转化的方法。目前，运用这种方法鉴定了许多植物转录因子的 玉米 C 端和 N 端序列与 告基因融合，稳定转化到烟草植株或瞬时表达在洋葱中，表明该转录因子包含两个 个是单位点 ( ，另一个为双位点 ( ，二者都能单独引导 入细胞核，但后者的作用更大。有趣的是， 位于负责 合的 中。突变分析表明，丧失 合能力的 白仍能进入细胞核，说明其核定位信号区并不等同于 合区，而是各自独立的发挥作用 ( 1994)。绿色荧光蛋白 (因是另一个用来研究转录因子核定位的报告基因，而且还能对蛋白进出细胞核的动态过程进行观察。但是，由于 子量小，短的 融合蛋白能在胞质与核之间自由扩散，所以当用来研究 ，通常将 起融合到 (et 1997)。 转录因子生物学功能的研究方法 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 7 以上只是根据转录因子的结构来研究其结构域与功能的一般信息，要全面、深入了解其生物学功能还得利用基因缺失和超表达 (et 1998)，从植株表型、生理代谢、基因表达等层次进行综合分析。 基因功能缺失突变体 研究基因功能最理想的办法是敲除 (者丧失掉该基因，观察突变体的性状。传统的获得突变体的方法通常是通过筛选自然突变体或用辐射、化学诱导剂处理，这些方法主要缺陷是不定向性。现在发展了一些效率相对较高、特异性强的方法，如反义抑制 (共抑制 ( 转座子插入突变和双链 涉 (。 反义抑制是将基因的完整或部分编码序列反向插入高活性的组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过转化，获得转基因植株。转基因植株中该序列所表达的 其靶 互作用，从而抑制相应内源基因表达 (et 2000)。共抑制是指正向的基因全长序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得转基因植株。转基因植株中该序列所表达的 制了相应内源基因的表达 ( J, 2001)。目前，用这两种策略己成功地鉴定了一些转录因子的功能，但它们的局限性是显而易见的。两种方法都有可能导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应，很难从表型鉴定出所需的转基因植株；反义抑制的抑制作用只需 50 异性较低。这使得利用该方法研究那些高度保守的基因家族的转录因子时，很难产生只抑制目的转录因子表达的突变植株；抑制作用只发生在某些转基因植株中，研究一个转录因子需培育大量的转基因植株，才可能筛选到有意义的突变体 (et 1990