【毕业学位论文】（Word原稿）甲胺磷的免疫分析技术研究生物物理学学位论文

密级（） 论文编号（） 中国农业科学院 硕士学位论文 甲胺磷的免疫分析技术研究 C o d e： T h e s i s N o . A I 摘要 随着全球民众对生态环境和人身安全的保护意识不断提高 ,各种农药在 农业生产中的残留对环境和人类健康形成的威胁受到日益关注。本文通过对甲胺磷的免疫 分析 技术的研究，探索了几种 有机磷农药的合适的快速检测方法。 本 文采用 多克隆抗血清制备技术 ，分别采取 碳化二亚胺法 和戊二醛法制备的甲胺磷 疫新西兰兔获得几种不同的多克隆抗体。 本研究通过合成了甲胺磷 组胺 标记物，建立了甲胺磷的均相放射免疫分析方法，方法检出限为 ，变异系数 之后，将纯化后的抗体 立了甲胺磷固相放射免疫分析，方法检出限为 ，变异系数 酶免疫 分析 法 (法是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术 。本研究通过合成甲胺磷 立了直接竞争法甲胺磷 法检出限为 5700pg/，变异系数 通过生物素 法检出限为 1140pg/，变异系数 通过合成兔抗甲胺磷 立了甲胺磷硝酸纤维膜酶免疫渗滤法，方法检出限为 10014ng/。 本研究采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒，标记经亲和层析纯化的兔抗甲胺磷 行了甲胺磷硝酸纤维膜胶体金免疫渗滤法和胶体金免疫层析法的探索。 研究结果表明 ，对于免疫定量测定农药残留目前以酶联免疫为佳，而今后的发展方向为化学发光免疫分析，时间分辨荧光免疫分析及免疫传感器。对 于免疫定性测定农药残留目前以斑点酶联免疫渗滤法、斑点免疫金渗滤法为佳，今后的发展方向为金标 免疫层析法 。 关键词：甲胺磷，放射免疫分析，酶联免疫分析，金标免疫分析 In 25 I 25 I a a a is in In DC IA in of in In 25 I to a of a of is in In a 5nM = 1nM =, a a on a NC A is is by in in is IA it is it is in be of at is it 录 第一章 引言 . 1 世界对农药残留污染日益重视 . 1 胺磷的物理，化学，生物性质 . 1 疫检测方法概述 . 5 文 的研究内容 . 11 第二章 人工抗原和抗血清的制备与纯化 . 12 料 . 12 验方法 . 13 果 . 17 论 . 20 第三章 甲胺磷 放射免疫分析的研究 . 22 料 . 22 验方法 . 23 果 . 28 论 . 30 第四章 甲胺磷 酶联免疫分析的研究 . 32 料 . 32 验方法 . 34 果 . 39 论 . 44 第五章 甲胺磷 金 免疫 层析技术的研究 . 49 料 . 49 验方法 . 49 果 . 53 论 . 54 第六章 结论 . 56 考文献 . 58 致谢 . 61 作者简历 . 62 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 本世纪七八十年代以来，随着全球民众 对 环境意识提高 ， 对生态环境和人类的安全保护的要求不断高涨 ,各种农药在 农业生产中的残留问题对人类健康和生态环境逐渐形成的威胁日益受到关注。 1985年 ，欧共体颁布的饮用水标准就规定任何一种农药最大的允许浓度为 ；欧盟 1999年发布关于茶叶中农药最高限量多数为 2001年，美国针对杀虫剂颁布了新的法规； 2004年，日本开始实施新的食品卫生法修正案，加大了对农残药残的检测力度。种种迹象表明，全世界对农药残留问题越来越重视，而 我国在此方 面虽然稍有滞后，但自九十年代以来也开始重视农残、药残在食品安全、 环境保护等方面的问题。在有机氯杀虫剂已经停用的情况下，有机磷农药成为目前主要的农药污染源，其污染问题日益突出。 2 3 月 26 27日，国家经贸委、农业部 在北京 联合召开了有关部委领导、相关企业、大专院校、科研单位高毒有机磷农药削减方案座谈会，对甲胺磷、久效磷、甲基对硫磷、对硫磷和磷胺做出规定：2月 31日前，更换这 5 个高毒农药品种的登记 (包括混剂 )，撤销在作物 (棉花除外 )上的登记， 2月 1 日开始，禁止在作物 (棉花除外 )上使用； 2月 1日起，除保留出口和应急装置外，全部禁止高毒有机磷农药的生产，从 2 1 月 1 日起，全部禁止这 5 个高毒农药品种在农业上的使用。因此，如何对这些高毒农药进行有效的监管，特别是快速 测定蔬菜中有机磷 农药的残留量，已成为有关分析检测部门研究的重要课题之一。本文 拟通过对甲胺磷的免疫检测分析的研究来探索适合中国国情的有机磷农药的快速检测方法。 学、生物性质 （郭联杰， 1986） 称 中文名称：甲胺磷； O,灭磷；克螨隆 英文名称： O,O, 编号 号： 0176 ： 10265： N 编号： 2783 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 号： 015 理化特性 化学式： 子式： 分子量： 状：纯品为白色针状晶体，工业品为无色粘糊状液体，冷却或放置后解析出针状晶体 ,有刺激性气味。 熔点： 相对密度： 气 =1） 蒸气压： 4 10 5 0 ) 溶解度：易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂和氯 化烷烃，在苯、甲苯、二甲苯中溶解度不超过 10% 油水分配系数：辛醇 /水分配系数的对数值： 危险性 纯品在 185可迅速分解。燃烧时，生成氮氧化物。与强碱接触，该物质发生分解，生成有毒烟雾（氮氧化物），腐蚀低碳钢与含铜合金。 理 性毒性： 大鼠经口 大鼠吸入 9mg/大鼠经皮 50mg/大鼠腹腔注射 15mg/小鼠静脉注射 10mg/小鼠经口 14mg/小鼠吸入 19mg/小鼠腹腔注射 豚鼠经口 30mg/豚鼠皮下注射 10mg/ 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 性毒性： 甲胺磷对鸡未产生迟发性神经毒性，对小鼠蓄积毒性不明显，大鼠几周喂饲试验对胆碱酯酶的最大无作用剂量为每月 变性： 微核实验阳性：小鼠腹腔注射 6mg/鼠经口 84mg/续 1 周；小鼠经皮 96mg/ 周间歇染毒。 细胞遗传学分析：小鼠其他细胞类型 2单体交换：小鼠腹腔注射 6mg/鼠其它细胞类型 250 g/L。鼠伤寒沙门氏菌 剂量高达 104 g/皿，加或不加代谢活化系统，均未显示有回复突变作用。小鼠骨髓细胞染色体畸变试验（ 5mg/下注射两次）和小鼠及大鼠骨髓细胞微核试验以及显性致死试验均未显示有诱变性。 畸性： 大鼠经口最低中毒剂量（ :10mg/ 6 )，致胚胎毒性、中枢神经系统发育异常及眼、耳发育异常。 毒机制： 抑制 胆碱酯酶，使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱在体内蓄积，引起神经功能紊乱 。 床 性中毒表现： 短期内接触（口服、吸入、皮肤、粘膜）大量有机磷农药后一般发病较快。经皮肤吸收，潜伏期较长，在 12 小时内发病。症状表现为食欲减退、恶心、呕吐、腹痛、流涎、多汗、视物模糊、瞳孔缩小、呼吸道分泌物增加、支气管痉挛、呼吸困难、肺水肿；烟碱样症状表现为肌束震颤、肌痉挛、肌麻痹；中枢神经系统症状表现为头痛、头晕、失眠或嗜睡、乏力、烦躁、谵妄、抽搐、昏迷、脑水肿。口服中毒时病情较重，胃肠道症 状更明显，部分病例可有心肌、肝、肾损害。 性中毒分级 现头晕、头痛、恶心、呕吐、多汗、胸闷、视物模糊、无力等症状，瞳孔可能缩小。全血胆碱酯酶活性一般在 50% 2. 中度中毒：还有肌束震颤、瞳孔缩小、轻度呼吸困难、流涎、腹痛、腹泻、步态蹒跚、意识清楚或模糊。全血胆碱酯酶活性一般在 30% 现肺水肿、昏迷、呼吸麻痹、脑水肿。全血胆碱酯酶活性一般在 30%以下。但胆碱酯酶降低水平与病情可不完全平行。 周围 神经病：少数严重急性中毒患者，治愈后经 2时间出现肢体麻木、乏力、手套袜子型感觉减退，甚至出现四肢或手部肌肉萎缩。此因神经靶酯酶（ 性受抑制所致，与胆碱酯酶无关。检查血淋巴细胞 性见降低，神经 发性猝死：少数严重急性中毒患者，经治疗后病情已基本恢复，但在 3后可能发生突然死亡。可能由于心源性猝死，主要为心脏传导功能障碍所致或由于农药内含的杂质（如中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 三烷基硫代磷酸酯类）引起迟发性肺水肿，发生成人呼吸窘迫综合症致死。 接触：液 体溅着眼后致局部疼痛、流泪等刺激症状，并可引起瞳孔明显缩小，后者与全身中毒的严重程度可不一致。 肤接触：部分患者可发生皮炎。 性中毒表现 长期 少量接触可致全血胆碱酯酶活性持续而明显地下降并出现神经衰弱综合症 及多汗、肌束震颤等。但目前对是否存在慢性中毒尚有争议。 谢途径 文献报道（ 002） 32P示甲胺磷的基本代谢途径为 ： 图 1胺磷在生物体内的代谢图 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 高效液相色谱 (气相色谱（ 气相色谱与质谱联用 (S)一直 是 农药残留检测的国家标准。这些仪器分析需要复杂的前处理、昂贵的仪器设备、熟练的技术人员，完成一次分析费时费力，成本又高，难以满足现场检测和环境监测中大量样品的快速检测需要。而免疫分析是以抗原与抗体的特异性结合为基础，其原理是利用生物分子识别，灵敏度高，特异性强，故在临床医学上应用极广泛。 80 年代初， 先将免疫分析用于农药残留分析。农药免疫分析法不但具有比常规分析法更高的灵敏度，而且无须使用昂贵仪器设备，方法简便快速， 在农药残留的快速筛选和定量检测以及现场快速检测方面显示独特的优势 ，因此受到食品安全 、环境监测工作者的重视。尽管免疫分析用于农药残留检测也有一些 局限性，但仍然发展得很快。下面对免疫检测技术进行具体介绍： 射免疫分析 (放射免疫标记技术 (将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异 性相结合，以放射性同位素作 为示踪物的标记免疫测定方法。 由于此项技术具有极高的灵敏度 ，可检测出含量低至 10 12 M 至 10 18 M 甚至更低浓度的超微量物质， 具有 特异性强、重复性高、样品处理步骤少、一次可进行大量样品测定、可完全自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床诊断中广泛应用于各种含量极低的各种蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。目前临床实验诊断所用 乎全部 为 125 I 标记物， 3 H 标记物早已被淘汰。 125 I 标记物的 放射免疫 分析与 3 H 标记物 放射免疫 分析 法 相比优点是 标记物比活度高，因此方法 特异性强、灵敏度高、精确、简便易行 ，成本低廉 。 虽然在 最早建立的农药免疫法中 了很大比重， 包括 狄氏剂、艾氏剂、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法 ， 但这些 主要以标记方便的 3 H 标记物为主（ 125 I 标记物的 放射免疫 分析所 占比例极低），因而 需 要 使用 液体闪烁 计数器， 成本比较高，只能用于科研，没有实用价值。而 125 I 标记物的 放射免疫 分析的标记技术要求必须合成含酪胺酸衍生物的标记前体，对人员的技术要求较高。 免疫法 (酶免疫 分析 法 (基本上是指其中的 酶联免疫吸附分析法( 是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方 法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。 目前常 用 的酶 标记物 是 辣根过氧化物酶( 碱性磷酸酶 ( 记物 。酶标 记物 制备 方法简单，产物 稳定 ，费用 低 廉。酶中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 免疫分析的灵敏度 虽低于 放射免疫 分析 技术， 但通过生物素 射免疫分析 技术 相同的灵敏度。 目前农药监测中应用最广泛的免 疫分析技术 ， 快速发展，主要是由于其 可靠 性 强 、灵敏度 高、 分析时间 和成本低廉 。许多环境化合物的特异性单克隆和多克隆抗体的制备及应用为 快速发展奠定了基础。 美国环境保护机构 (发了野外便携式和实验室 法，其主要目标是建立便于野外监测危险污染物的简便方法。监测的靶分析物包括多氯联苯、苯、甲苯和二甲苯混合物、硝基芳烃化合物、对硫磷、 其它杀虫剂。美国食品药物管理局 (要将 发了天然霉素 (黄曲霉素 )、 化合物的免疫分析检测方法。美国农业食品安全检查部门 (助开发了除草菊酯、有机氯杀虫剂及其它化合物的免疫分析法，并采用现有的方法来完成其监测任务。 近年来， 已经有不少商品化的 剂盒， 待测物 包括 一些 杀虫剂、杀菌剂和除草剂。这种试剂盒配上便携式分光光度计可实现野外定量快速测定，检测灵敏度为 25着农药监测中的应用范围的不断扩大，一些新方法也不断涌现。 文献报道（ 1992）用 检测 了水样中的污染物 2,4嗪， 将其与气相色谱分析结果进行比较 ；（ 1991） 利用 环境水样中苯并芘进行了测定。 （ 1990） 利用 土壤和水中三氮杂苯类除草剂进行了测定 ；（ 1987） 等利用 测土壤中的 1989） 用酶免疫分析法检测残留在食品中的三嗪。 （ 1987） 通过改变温育时间，提高了 测三氮杂苯类除草剂的灵敏度。我国的研究 人员 也自行开发了一些 ， 如（ 刘长武 ， 1993） 应用 梨、苹果中的对硫磷残留进行了测定。 （ 余万俊 ，1995） 制备了杀虫脒的特异性抗体，并以此抗体建立了大米中杀虫脒残留的单克隆抗体 （ 阳传和 ， 1992） 应用 B 淋巴细胞杂交瘤技术，研究出特异性强的 素的单克隆抗体，并建立了小麦 素的 法 ；以及（ 周永新 ， 1994） 蓖麻毒素多克隆抗体的研究。 光免疫分析 ( 本世纪 40 年代， 用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原，首次创建了荧光抗体检测技术，但是该方法 灵敏度较低。 80 年代后，时间分辨荧光免疫分析法（ 出现，大大的提高了荧光免疫分析的灵敏度。时间分辨荧光免疫分析技术，是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。因而使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比 ，从而达到甚至超过了放射性同位素所的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。目前，时间分辨中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 荧光免疫分析法已广泛应用在生物学科，医学的各研究领域和临床实验诊断中。时间分辨荧光免疫分析法 虽然灵敏度高，重复性好，但由于成本较高目前在农药残留分析中还未广泛应用。 化学发光免疫分析和 电化学发光免疫 分析 化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方 式，其利用化学反应释放的自由能激发中间体 (常用碱性磷酸酶金刚烷胺 )，使其从激发态回到基态，当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而进行定量分析。化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度，并且 没有 放射 免疫 分析那样存在 潜在 的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析 方法。虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身 不 具有 特异性，因此，如同 定（ 术。 微量 检 测技 术， 80年代初，快速发展于 90 年代，在国外 其具备以下特点 ：灵敏度 高， 可 达 1017 1019 M； 特异性强，重复性好 ；测定范围宽，可达 7个数量级 ； 试剂稳定性好，有效期 可达 12 月 ； 操作简单，易于自动化。 电化学发光免疫测定（ 继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免 疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ 免疫测定相结合的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光（ 同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。 L 的差异在于 电启动发光反应，而 通过化合物混合启动发光反应。 目前，在实际应用中的电化学发光体系主要是钌联吡啶 Ru( 体系。它可以通过活化“手臂”实现与蛋白的连接。这种标记物非常稳定，且由于分子量小 (1000)， 可实现一分子蛋白标记多个Ru( 。电化学发光免疫分析有其突出的优点：标记物稳定，灵敏度高，可实现多元检测，可实现均相免疫分析，可实现全自动化。由于电化学发光免疫分析具有优越性，是一种很有发展前途的免疫分析法，日益受到人们的重视。目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测。 化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析虽然灵敏度高，重复性好，但由于成本较高目前在农药残留分析中还未广泛应用。 疫传感器 免疫传感器或免疫探针主要是利用抗原或抗体作为识 别元件，它可以对分析物连续、有选择性地进行检测。由于吸附常数较大，免疫传感器的主要缺陷是抗原抗体反应不具有良好的可逆性。最近有人利用催化抗体免疫传感技术克服了这个困难，因为催化抗体不仅起着结合作用，同时也从化学角度改变标记分子。 除了前述的光纤免疫传感器外，依据信号转换技术的不同，免疫传感器还可分为：压电免疫传感器、电化学免疫传感器、表面等离子免疫传感器等。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 8 电免疫传感器 压电免疫传感器的主要材料为石英，可用来直接检测抗原抗体反应。这种传感器已用于环境中阿特拉津、 2,4硫磷等农药 监测中。 化学免疫传感器 电化学免疫传感器是由抗原或抗体等分子识别元件和电化学电极组合而成，可以直接检测免疫试剂的结合反应。依据测定的方式的不同可分为： (1)电位免疫传感器 ： 主要测量电极表面固定抗原或抗体与其相应的抗体或抗原结合引起的电极表面电位变化，固定抗体的测量电极与参比电极间的电势差大小与相应自由抗原浓度有关。电位免疫传感器已用于环境中 2， 4草剂的检测。 (2)电流免疫传感器 ： 主要测量电极表面电活性物质被氧化或还原所产生的与其浓度大小成线性关系的电流，一般有氧化酶的参与。 利用双抗电流免疫传感系统对行了测定。 (3)电容免疫传感器 ： 主要测量电极板上抗原抗体反应所引起的电容变化，电容大小与电容极板表面的介电层 (固定抗原或抗体 )的厚度和介电性能有关。 利用 此类传感技术应用于葡萄糖的测定。 (4)电导免疫传感器 这类传感器与电容免疫传感器相似，主要通过测定电流变化从而测出两电极间传感层的电导变化。 文献报道（ 992） 利用这类传感器对环境中阿特拉津进行了测定。 面等 离 子体共振免疫传感器 表面等离子体是某一波长的光以一定角度照射到金属导体 (通常为银或金 )表面时所产生的一个瞬息电磁场区。当照射光的角度发生变化时，在某一角度反射光处于最弱，此刻能明显观察到表面等离子现象。这一入射角度与金属表面覆盖介质 (固定抗原或抗体 )介电常数有关，因而金属表面的固定抗原或抗体发生免疫反应时将影响这一角度变化。 文献报道（ 1993和 1994） 利用表面等离子体共振免疫传感器对环境中农药阿特拉津进行了测定。 光免疫传感器 将荧光免疫与光纤传感器结合形成的荧光免疫传感器是近 年来荧光免疫法研究十分活跃的领域。荧光免疫传感器是将抗体 (抗原 )固定在适当基底上，实现生化荧光信号向光电信号的转变，以对待测物质进行定量检测。测定环境中农药残留的分子识别元件可以是乙酰胆碱脂酶抗体和碱性磷酸酶等。文献报道（ 991）可通过 记的乙酰胆碱脂酶固定在石英纤维上以检测酶的活性。乙酰胆碱水解时产生的 H+猝灭纤维表面的荧光信号，荧光强度减弱。有机磷农药抑制乙酰胆碱脂酶的活性，从而降低荧光猝灭能力，可检测溶液中 10 8 M 的乙酰胆碱脂酶抑制剂 ，其响应时间小于 1献报道（ 1998）等将有机农药对硫磷抗体和 b 蛋白固定在石英纤维上制得荧光免疫传感器， 测定对硫磷的检测限为10 9 M。 用竞争性荧光能量转移法原理，用 记的多克隆氯乙异丙嗪 (体，用四甲基罗丹明标记农药氯乙异丙嗪，研制出光纤免疫传感器，通过增加能量转移的量改善了灵敏度。文献报道（ 1989）利用光纤免疫传感器检测农药中拟除虫菊酯(（ 1992）等以荧光和损耗波作用为基础，研究了光纤传感器对三嗪衍生物灵敏度和再生性，检测限 稳定使用 8 周以上并可循环测定 500 次；（ 1993）应用损耗波光纤为基础的免疫传感器还可直接检测地面水中 ng/平的蓖麻毒素。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 9 体金标记免疫分析技术 胶体金 (氯金酸 (水溶胶，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在 免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。 1971 年 先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。 1974 年， 用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快。 1978 年， 将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测 B 淋巴细脑表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色 ( 1981 年 银显影方法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。 1983年 ， 又加以改进，将免疫金染色与银显影技术相结合，称为免疫金银染色法(由于 种方法具有试剂制备简便，特异性强，灵敏度高，应用范围广，并可用于双重和多重标记等优点，被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中较常用的敏感方法之一。近年来，胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术 (液相免疫测定、固相斑点金银染色 (斑点金免疫 渗滤测定法 (多种标记免疫检测方法。 胶体金标记技术 (是以 胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定 大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态 。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多 种生物大分子结合。根据胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫 其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。 免疫层析法 ( 用于早早孕诊断成功后 兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶 体金或 藻红蛋白 染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。本法检测速度快，一般 五 分钟 内 可出结果 ，灵敏度 最 高可达 5ng/做的 好的试纸条 实验 结果 是准确可靠的，纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性，但与原材料选择特别是 的孔径大小密切相关，准确性取决于抗 体 的特异性。 近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法，快速斑点渗滤法即为其中一种，其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法 （ 。 用 虽然广泛 ，但 温育 时间较长， 如果一味 提高检测速度， 会 出现假阴性 的 结果。 需时较长的主要原因，是由于液相中的抗原（或抗体）需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应 。 快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。 测量大分子采用 夹心法：固定于膜上的多克隆抗中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 10 体标本中待测抗原金标记的特异性单克隆抗体显色。 小分子可以用 间接法：固定于膜上的抗原标本中的相应抗 原 金标记的抗抗体显色。 从 以上分析可以看出，胶体金标记技术是继 放射 标记技术 、酶标记技术、荧光标记技术、化学发光标记技术 之后，又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫 标记技术。 文 的研究内容 在 5个被禁用的高毒农药品种中选择甲胺磷作为研究对象，是因为 甲胺磷曾经是中国最高产量的农药，在国内生产能力最高曾达到 吨，产量超过 7 万吨 (1999 年为 吨 )，每年使用量 5 万吨左右，生产的厂家 48 个。甲胺磷从 20 世纪 70 年代初问世至 20 世纪 90 年代末，30 年久用不衰，曾为病虫害的防治工作做出过重要贡献。 甲胺磷经乙酰化生成的乙酰甲胺磷是低毒性有 机磷杀虫剂的一个重要品种，二者虽然结构非常接近（它们的化学名称 前者叫 O， S二甲基胺基硫代磷酸酯。后者叫 O， S二甲基乙酰基硫 代磷酸酯），但是二者的毒性、性能、防治对象和施用作物有较大差别。甲胺磷属于高毒农药 (致死中量 ) 大鼠急性经口为 21 mg/乙酰甲胺磷则属于低毒农药， 大鼠急性经口 823 mg/者的毒性相差 40 倍；甲胺磷的剂型有 50乳油和 粒剂 2 种，以前者最多， 具有较强的触杀、胃毒和一定的熏蒸、内吸传导杀螬卵作用。而乙酰甲胺磷只有 1 种剂型， 为 30或 40乳油，其有效成份比甲胺磷少 具有胃毒和触杀作用，内吸作用比甲胺磷强 ,作用效果比甲胺磷缓慢，在施药后 2 3 d 药效显著；甲胺磷主要用 于粮、棉、蔗，油作物多种害虫的防治，绝对禁止在蔬菜、茶叶上施用。而乙酰甲胺磷由于其毒性低、价格高，则主要用于蔬菜、茶叶、特作等价格较高的经济作物上防治多种刺吸式和咀嚼式口器害虫。因此它的生产量和使用量远不及甲胺磷，乙酰甲胺磷的使用量每年不到 1 000 吨， 主要原因是乙酰甲胺磷的合成，要通过醋酸酐对甲胺磷进行乙酰化，加大了成本，因而产量较低，至今尚没有发挥它在蔬菜、茶叶等经济作物病虫害防治中应有的作用。然而，当甲胺磷被禁之后，由于产能的存在，乙酰甲胺磷的产量可能有较大的提高。 甲胺磷和乙酰甲胺磷的水溶性都非常 好，在生物体内均匀分布，因此含水量高的样品可以通过简单的压榨出液体而直接进行免疫分析，这样最快可以在几分钟内得出结果，最大的体现了免疫分析的优点。而对于极性弱的农药