【毕业学位论文】（Word原稿）检测冠状病毒基因芯片的研制及犬冠状病毒膜蛋白和纤突蛋白基因的克隆预防兽医学博士论文

密级 论文编号 : 中国农业科学院 学 位 论 文 检测 冠状病毒基因芯片的研制及犬冠状病毒膜蛋白和纤突蛋白基因的克隆 国农业科学院博士学位论文 摘要 2 摘 要 冠状病毒可感染人和多种脊椎动物，与人和多种动物的疾病有关，具有胃肠道、呼吸道和神经系统嗜性。冠状病毒可分为 3 个群，包括十余种病毒，冠 状病毒以 先导引物转录机制 进行病毒的增殖，因此也导致了 冠状病毒极易变异，血清型众多，且新的变异株不断出现，不同型的毒株间缺乏交叉保护或仅有部分交叉保护，这都给冠状病毒的检测和防治带来了很大困难，但至今冠状病毒尚缺乏有效的检测方法。因此，建立有效的冠状病毒检测技术，对有效控制冠状病毒的流行非常重要。 研制具有 检测 价值的基因芯片和克隆犬冠状病毒有 检测 价值的抗原基因，对建立特异、敏感的冠状病毒 检测 检测技术有 重要的意义。 1、 冠状病毒 保守性 基因片段和不同种属冠状病毒差异基因片段的克隆 为了分离、鉴定冠状病毒特异的基因区及区 分不同种属冠状病毒基因片段，研制检测冠状病毒的基因芯片，本研究首先 对 每种冠状病毒设计 10引物， 分别 对 行 增， 克隆 并测序 了 90 个不同冠状病毒的基因片段 ，核苷酸测序和氨基酸序列 比较发现， 不同 冠状病毒间存在不同程度的差异，有用于区分不同种属冠状病毒的价值。同时针对相对保守的病毒 合酶基因，合成了可扩增出 3 个群中所有冠状病毒 251段的兼并引物，对 、 、 行 增和基因克隆，测序后与 、 59 株和 的核苷酸序列和氨基酸序列进行比较，表明该基因片段有用于 检测 冠状病毒及对不同冠状病毒分群研究的价值。 2、 检测冠状病毒基因芯片的制备及检测方法的建立 以 上述的基因克隆 为模板，用特异引物 进行 增，制备点样样品 ，点制冠状病毒基因芯片。并用该基因芯片对 机渗入标记和 机渗入结合 末端标记 病毒 行 检测，初步试验敏感性较低，未检测到杂交信号。 为了增加基因芯片对不同冠状病毒样品 记物的检测信号，进一步探索将每个冠状病毒中的 35 对引物分为一组建立多重 增标记体系，并用基因芯片对该体系进行检测，发现可对所有冠状病毒都检测出阳性信号，其中 因克隆与所有基因克隆间未见有交叉反应，具有很好的特异性；而冠状病毒 I 群的 基因克隆间出现交叉反应现象。 为了克服 I 群冠状病毒中交叉反应的问题，寻找具有诊断不同 冠状病毒种价值的基因片段克隆，进 一步利用 基因芯片对 分基因克隆的 一重 增并标记产物进行杂交筛选，发现筛选到的克隆可特异的区分不同种属的冠状病毒。用筛选到 的基因克隆 ，重新制备基因芯片，用该基因芯片 对不同冠状病毒 多重 增标记物进行检测，发现针对冠状病毒 合基因克隆可有效区分其它病毒和冠状病毒。而克隆 特异的检测 隆 特异的检测 隆 特异的检测 隆 、 特异检测 隆 特异检测 隆中国农业科学院博士学位论文 摘要 3 特异检测 隆 特异检测隆 特异检测 传统的多重 病毒 检测相比 较，敏感性至少高出 1000 倍，可检测到 10病毒 3、 犬冠状病毒膜蛋白基因和纤突蛋白基因的克隆 犬冠状病毒的 M 和 S 蛋白基因国内报道较少，可进一步研究两基因及其对病毒进化、分型和诊断的应用，根据已发表的 和 S 蛋白基因序列，分别设计 一对 特异 的引物 ，分别扩增7001241段， 5端加有 和 端加有 切酶位点，对病毒 行 并克隆 测序 。并与 、 1、 259、 、 、 、 和 陆的 序列 比较，结果 表明 犬冠状病毒 不同毒株间 M 蛋白基因 核苷酸 序列和氨基酸序列的同源性较高，分别为 不同动物冠状病毒 M 蛋白 氨基酸的同源性 则较低，为 说明利用 M 蛋白可有效对犬冠状病毒进行检测。而 犬冠状病毒 不同毒株间 苷酸 序列和氨基酸序列的同源性较低，分别为 但保守区段的 S 蛋白可有效提高检测的信号，也可 对犬冠状病 毒进行检测。同时构建了 达质粒 ， 为进一步 利用重组 M 和 S 蛋白 对犬冠状病毒感染的检测奠定了基础。 关键词：冠状病毒，基因芯片，犬冠状病毒，膜蛋白基因，纤突蛋白基因 中国农业科学院博士学位论文 摘要 4 of of to of by is of is of is no of To is of of It is to of 1. NA of of n to of is A of 51bp NA of 59 in It in of 10of 90 is be in 2、 is in CR NA of by or by no is of In to is CR by of up -5 of CR by No in of CR 国农业科学院博士学位论文 摘要 5 by in of is is by of by NA be in be in be in be in be in be in be in be in be in be in by is at 000 by 103. CV ow of 00bp 241bp to of CV of CV in is of in is be of CV in is CV in to or CV 国农业科学院博士学位论文 目录 6 目 录 附录清单 . .要符号表 . 2 第一部分 引言 . . . . 4 冠状病毒 一般生物学特性 . . .冠状病毒分子生物学 究进展 . . . . 冠状病毒诊断方法研究进展 . . . . . 16 第二部分 不同冠状病毒特异基因的克隆及序列分 .料和方法 . .果 . . 论 . 三部分 通用引物对不同冠状病毒 合酶基因的克隆及序列分析 . 料和方法 . . . 果 . . . 论 . . . 四部分 检测 冠状病毒基因芯片的点制及对不同冠状病毒病毒 多重 增标记产物的检测 . 料和方法 . . . 54 果 . . . 61 论 . . . 69 第 五 部分 检测 冠状病毒特异基因芯片的点制及不同冠状病毒 的检测 . . 料和方法 . . . 国农业科学院博士学位论文 目录 7 果 . . . 论 . . 六部分 犬冠状病毒 膜蛋白基因的克隆、序列分析及 表达 载体的构建 . 料和方法 . . 果 . . 论 . . 七部分 犬冠状病毒 . .料和方法 . . .果 . . . .论 . . . . 论 . 115 参考文献 . 116 附 录 . 130 致 谢 者简介 国农业科学院博士学位论文 附表清单 1 附表清单 附件 1： 130 附件 2： 不同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 件 3： 9不同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 .件 4： 9不同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 件 5： 同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 144 附件 6： 同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 .件 7： 不同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 146 附件 8： 不同基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 148 附件 9：通用引物对不同冠状病毒 合酶基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 151 附件 10：芯片点 样样品回收 物浓度 测定结果 153 附件 11： M 基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 .件 12： 同毒株膜蛋白基因核苷酸序列同源性分析 件 13： 同毒株膜蛋白基因氨基酸序列的同源性分析 162 附件 14： 不同冠状病毒膜蛋白氨基酸序列的同源性分析 164 附件 15： S 基因克隆的核苷酸和氨基酸序列 .件 16： 同毒株 S 基因核苷酸序列同源性分析 168 附件 17： 同毒株 S 氨基酸序列的同源性分析 173 中国农业科学院博士学位论文 主要符号表 2 主要符号表 苄青霉素 氨基肽酶 -N 基对 冠状病毒 补 瘟热病毒 细小病毒 呼吸道冠状病毒 肾细胞系 乙基氨基乙基 碳酸二乙 酯 硫苏糖醇 化乙锭 乙胺四乙酸 联免疫吸附试验 镜技术 猫 氨基肽酶 肠炎 冠状病毒 传染性腹膜炎病毒 g 冠状病毒 凝素脂酶 -(2-(2h 时 传染性支气管炎病毒 疫球蛋白 A 疫电镜技术 疫荧光技术 疫过氧化物酶试验 碱基对 克 中国农业科学院博士学位论文 主要符号表 3 M 蛋白 传染性肝炎病毒 钟 克 升 使 式 放阅读框架 合酶链式反应 体结合结构域 糖核酸 分钟转数 转录 突蛋白 重急性呼吸综合症 泌型 基因组 二烷基黄酸钠 面的糖蛋白 录相关序列 传染性胃肠炎病毒 l 升 m 米 毒分离 毒中和试验 43 中国农业科学院博士学位论文 引言部分 4 第一部分 引言部分 犬冠状病毒 （ 可引起犬冠状病毒性胃肠炎，一种以胃肠炎为主要症状的高度接触性传染病， 临床上以犬严重脱水、呕吐、腹泻和血便为主要特征，致死率较低，但 与 其它传染病混合感染时，死亡率 提 高 ， 对幼犬危害严重，发病率和致死率都很高。目前，世界很多国家均已发现本病，是对养犬业危害较大的疫病之一。 同时，大都市宠物数目日益增加，犬 的健康与否与人类健康密切相关，同时以 代表的冠状病毒极易变异，导致冠状病毒血清型众多，且新的血清型还在不断出现，对 诊断和免疫预防带来了更大的困难。同时 犬的中毒性和细菌性肠炎、急性胰腺炎、肝、胃肠的疾病、球虫病及犬细小病毒、轮状病毒感染也可引起犬肠炎的发生，导致呕吐、腹泻，根据流行病学特点、临床症状和病理变化很难做出准确诊断，这都给该病的诊断带来了困难，最后的确诊还得靠电镜观察、病毒分离、血清学试验和分子病毒学等诊断方法，只有将两者有机的结合起来，才能够有效的进行诊断，防止犬冠状病毒性肠炎的发生 ，促进养犬业的健康发展。 因此迫切需要了解 我国和上海地区的遗传变异规律和流行情况，所以应用分子生物学等技术加强 基因结构与功能，基因变异机制等研究，应用现代生物技术建立更为特异、敏感、快速的诊断和检测技术，对 流行情况进行调查，弄清 免疫诊断，从而制订更好的、有针对性的防制措施，以便更好的诊断、防制和最终消灭犬冠状病毒性肠炎。 冠状病毒 的一般生物学特性 分类地位 及流行情况 犬冠状病毒（ 于尼多病毒目 (冠状病毒科 (冠状病毒属（ 冠状病毒 I 群， 该群还包括人冠状病毒 （ 29E，猪传染性胃肠炎病毒 （ ，猫传染性腹膜炎病毒 （ 和猫肠炎冠状病毒 （ 病毒 。 先是由 （ 1974）于 1971 年从腹泻的德国军犬中分离到的。现在认为是犬的一个重要的，但还未被完全弄清的病原。自从 欧洲得到证实后，就呈现世界范围内地方性流行。美国（ 1975、 1979），德国（ 1975），英国（ 1973、 1980），比利时（ 1978），法国（ 1980），泰国（ 1979）等许多国家和地区都有过大规模的 行（高偲琥， 1994）。在荷兰对健康犬和爆发肠炎犬群的血清学研究揭示，在健康和腹泻的犬群中有较高的 体阳性率。在几个国家进行的 清流行病学调查显示： 染率 从 0 到 80%不等；在一次大范围的调查中，报道在健康犬中有 45%的血清学阳性率，而腹泻的犬中有 61%的血清学阳性率。总的来说，在地方性流行的犬群中检测到高的阳性率，而在家庭养的和随机来源的试验犬相对较低。 中国农业科学院博士学位论文 引言部分 5 形态和理化特性 子具有冠状病毒的一般形态特征，呈圆形或椭圆形，长 60 200 75 80 囊膜（殷震等， 1997），核衣壳呈细丝状，直径 9 13 旋对称。 的浮密度为 g/状病毒粒子的负染电镜结果：由大约 12 24 ，末端约 10 棒状花梗样表面突起呈皇冠样。表面突起空间分布，分散于病毒粒子的表面。象其它有囊膜病毒一样， 热、脂溶剂、非离子去污剂、乙醚、氯仿、去氧胆酸盐和和氧化剂敏感。易被福尔马林、紫外线等灭活，但对酸和胰酶有较强的抵抗力，在 20件下还能存活，这是病毒经胃酸作用后仍有感染活性的原因，在 冻干 4下可保存数年， 血凝与血吸附性。 体外培养 病毒可在多种犬和猫的细胞系中增殖，如原代犬肾细胞，犬胸腺和皮肤纤维瘤细胞（ 猫 细胞系（ 肺细胞）， 胞和整个猫胚胎细胞。细胞和动物种属的敏感性最近报道与氨基肽酶 存在与否有关。细胞病变（ 不明显或缺乏特征性病变， 典型病变为：细胞相互分离后，细胞增大，形态奇异。一些 离株在组织培养中引起大的细胞融合，形成多核巨细胞。 病毒的侵入依靠细胞的内吞噬作用，冠状病毒完全在细胞质中复制，由内质网和胞浆空泡膜上出芽成熟。与正粘病毒和披膜病毒等其它囊膜病毒比较，病毒的增殖相对较慢。隐蔽期至少持续 6 个小时，直到感染后 24 小时才达到最高的含量。病毒增殖的最佳温度 为32 33 ，高温下病毒感染性会很快丧失，或延长孵育的时间。 抗原群 最近研究表明：冠状病毒由四个抗原群组成，这些抗原群可通过宿主感染范围，免疫荧光，中和试验， 免疫电镜技术确定。属于同一抗原群的病毒有部分抗原交叉活性，每个群中存在几个亚型。不同宿主感染范围，引起的疾病，也可通过它们的基因组和抗原结构鉴定这些病毒群。因为从腹泻的幼犬中分离的 株中发现了抗原的差异，所以用特定血清型免疫的犬可能对同一病毒的其它血清型敏感。这种抗原型较多被认为是由于突变和基因重组 造成的。 致病性 小肠表面上皮细胞是 结肠可抵抗感染。经口感染后 2天内，可在十二指肠的上三分之二处发现 犬细小病毒 毒常见分布于整个小肠中感染的微绒毛中。此时，可从肠系膜淋巴结，有时也可从肝和脾中分离到少量病毒。应用荧光抗体染色，可在小肠上皮的顶部发现特异荧光细胞，电镜负染和免疫组化法检查发现，在病犬和健康犬的肝、肾、脾和肠系膜淋巴结 ，甚至在心脏也存在 在其它情况下，如在 犬瘟热病毒免中国农业科学院博士学位论文 引言部分 6 疫或免疫抑制，可证明 腺和肺中存在， 但未发现其复制的确切部位和特征性病变。实质脏器中的病毒来源有两种可能，一是肠道中的病毒进入血流，随血流分布全身，暂时停留在组织细胞间；另一种可能是 有泛嗜性（ 胡桂学 等 ， 1997）。在强毒株感染后 7、 14、 21、 28和 35天扑杀试验犬，应用 感染后 7 21天，病毒随淋巴液、血液循环分布于全身各组织器官，在第 14天病毒含量最高，21天后，随着血清中和抗体的产生和升高，机体建立了坚强的免疫力，病毒血症逐渐消失，体内的病毒绝大部分被吞噬、分解，并排出体外，到 28天检测不到病毒（ 余春等 ， 2001c）。 这一时期，粪便中病毒含量最高。接下来，消化酶缺乏，吸收障碍时，可导致一些幼犬在感染 18 72小时后见到腹泻，并常见持续数日。 实验室和田间试验显示：同时感染 犬比单独感染其中之一的病毒的犬会引起更为严重的疾病。死亡常见于双重感染。在最近的报道中，可从验尸的犬 中分离出 是因为 感染明显加剧了 为持久的严重感染。因此研究表明：在同窝的仔犬中， 5 天出现严重的出血性肠炎而导致死亡。定位于粘膜的抗体（ 产生会限制病毒在肠内的扩散，抑制感染的进程。大约感染后第 7 天十二指肠的小肠微绒毛恢复，接着整个小肠的微绒毛很快恢复。病程停止，粪便中的排毒降低。 行病学 有报道说 些 出现轻度腹泻或无症状。但仅从腹泻的山 狗中分离到 阿拉斯加州 成年狼在秋、春季的感染率为 32%和 76%（ et 2001）。国外也有 et 1993； et 1996）和野猫 (et 1999； et 1999)的报道，国内有 高风山等， 2003）。不同品种、年龄、性别的犬都易感，但以 2幼犬更易感并形成临床症状，死亡率比成年犬高（何永亮等， 1996），出生后 2经免疫的犬的病死率高于免疫犬。因为 以还不清楚由犬冠状病毒诱发的自然宿主发病范围。 自然传染途径为粪 露于易感动物的感染宿主排出粪便中的病毒是主要的传染源 （ et 1981; et 1993; et 1997） ， 在一些犬中出现临床症状时，但与其接触的动物并没有疾病发生。 据报道， 在粪便中存活 6 9 天，在水中保持数日仍有活性，故一旦发病则流行很快，发病犬与犬群密集程度成正比；本病一年四季均可发生，但冬季多发，有资料报道，在美国，本病死亡率较低，我国感染本病后死亡率却较高，这可能是病毒毒株的毒力较强所致（高偲琥， 1994）。 染后 6 9 天粪便开始排毒 （ et 1976） ，严重感染犬粪便可持续排毒 6 9 天，但在幼犬中，当临床症状消失后，排毒时间会延长。 经胃时不会发生改变，没有观察到病毒血症和全身感染。 该病的发生和严重程度常和断乳、运输、气温骤变、饲养管理条件 恶化以及年龄、应激或其他病原混合感染等因素有关，病犬和带毒犬粪便中含有大量 染了饲料、饮水、笼具和周中国农业科学院博士学位论文 引言部分 7 围环境，直接或间接地传染给易感犬，最近有人报道，电镜负染检查一新生仔犬的肠内容物，发现有 粒子，提示 在垂直感染的可能性（胡桂学等， 1997e）。 病症状 及 病理变化 该病的潜伏期较短，感染后 1 3 天可见呕吐和腹泻，当临床症状出现时，传播很快。粪便可能会呈水样，有时有条纹状带血，有时有恶臭气味。幼犬变的脱水，即使用输液治疗也必须在早期，精神沉郁，食欲不振。在有些情况下 ，可观察到感染但没有发热的症状，尽管体温升高。与 比，没有观察到白细胞减少。呕吐也没有 染严重，发病第一天过后，呕吐减轻，但腹泻可持续多天，甚至 3 4 周。由细菌、寄生虫和诸如细小病毒、轮状病毒等其它病毒的继法发感染可能延长发病。不管怎样，犬大多会在一周内自发恢复，但有时会可能持续 2 周，甚至更长时间。单独感染 致死率一般很低，但也有犬感染 死亡报道，特别在幼犬中。 主要呈现不同程度的胃肠炎变化，尸体严重脱水，犬肺颜色鲜红，肾肿大，据有关报道，该病毒主要侵害位于小肠绒毛 2/3 处的 消化吸收细胞、局部肠系膜淋巴结，偶尔也可侵害肝和脾脏，故其损伤胃肠道使胃肠上皮细胞死亡脱落，导致小肠绒毛发生萎缩。消化道内病理产物可刺激胃肠道微循环，使其充血、粘膜水肿甚至细胞脱落，出现急性卡他及胃肠炎症状；