【毕业学位论文】（Word原稿）山羊传染性胸膜肺炎病原的分离及其中国分离株的分子特征分析预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 山羊传染性胸膜肺炎病原的分离及其中国分离株的分子特征 分析 I 摘 要 山羊传染性胸膜肺炎（ 重影响亚洲和非洲山羊养殖业的发展， 被世界动物卫生组织（ 为 B 类传染病。自 上 世纪末首次分离到 原并证实该病病原为山羊支原体山羊肺炎亚种（ e,来，已经有三十多个国家报道有此病发生，但是仅有十一个国家分离到 病原体。 本实验取临床上疑似感染山羊传染性胸膜肺炎的山羊肺脏，作无菌处理后将匀浆液接种液体培养基培养，当培养液颜色变黄时，涂固体平板培养，挑取单克隆菌落，再接种液体培养基。经过三次克隆纯化后进行生化实验、电镜观察、 酶切鉴定、克隆、测序等 基因 特征鉴定，分别分析了菌株在三个不同基因片段的同源性，并与 准株 准株 表株 羊肺炎支原体（ 准株行了遗传进化树分析。结果表明，该病原体在分子特征上属山羊支原体山羊肺炎亚种。 将生化实验、电镜观察 、 基因 特征鉴定为山羊支原体山羊肺炎亚种的病原体扩大培养，取第三代培养物（ 15108气管接种两只山羊，每日测量体 温，观察 山 羊 临床表现。其中一只典型发病，体温升高到 。 测 体效价明显升高，其中 体变化与临床表现基本同步。剖杀后的病羊肺组织做显微病理检查，呈现典型的纤维素性胸膜肺炎病变。并从病羊肺中再一次分离到该病病原体。 结果 表明，本研究分离到的支原体在分类地位上归属于山羊支原体山羊肺炎亚种，人工感染试验 进一步 证明 其为山羊传染性胸膜肺炎病原体。 在对 7001、 87002、 1653、 367进行分子特征研究中，针对三段基因（ A、 B、C），对 和序列测定，将结果与丝状支原体簇的 6个成员进行遗传衍化分析。在 4株中国分离株的扩增产物经 38相同，为 54820128条带，其他 5个丝状支原体簇成员只有 420128条带。在 列分析结果显示 4株中国分离株与 与山羊支原体山羊亚种 与丝状支原体山羊亚种 在 4株中国分离株的序列与 与两株 601 与三株 709738的同源性为 通过对中国分离的 87001、 87002、 367、 1653等 4株 次提出其与山羊支原体山羊肺炎亚种 (缘关系最近，应归属为 次将国内流行的山羊传染性胸膜肺炎的病原定名为 关键词 ： 山羊传染性胸膜 肺炎，丝状支原体山羊亚种， 山羊支原体山羊肺炎亚种 ， 病原分离 is a of is in of of at of to be . 976 0 in 1 In a of of a of by by by CR EA,D3 to by D3 of . gM a gG We of of M So we by to of NA of CR 48 420 28 bp 38. of 38, id mC Z. 2 2 cc 601 7097 87001、 87002、 367、 1653, So we is 录 第一章 绪论 . 1 羊传染性胸膜肺炎研究进展 . 1 原 . 1 行病学 . 2 病机制 . 3 床症状 . 3 理变化 . 4 断 . 4 治措施 . 7 究目的与意义 . 8 究内容与方法 . 9 株山羊支原体山羊肺炎亚种的分离与鉴定 . 9 内分离株的分子特征研究 . 9 第二章 一株 原体的分离与鉴定 . 10 料和方法 . 10 料来源 . 10 养基 . 10 离培养 . 10 养物实时监测 . 11 学显微镜观察 . 11 化试验鉴定 . 11 养物 增及酶切鉴定 . 11 养物基因特征鉴定 . 11 体的收集 . 12 工感染实验 . 12 菌体抗原的制备： . 12 清学检测 . 12 果 . 13 离与纯化 . 13 微镜观察 . 13 化特性 . 14 酶切 . 14 因特征鉴 定 . 15 工感染山羊临床表现 . 19 理变化 . 19 工感染山羊血清学变化 . 21 原再次分离 . 21 论 . 21 第三章 山羊传染性胸膜肺炎病原体国内分离株的分子特征研究 . 24 料与方法 . 25 种及培养基 . 25 物设计 . 25 种培养及纯化 . 25 增 . 26 酶切鉴定 . 26 物克隆及序列分析 . 26 果 . 27 体 增结果 . 27 切鉴定结果 . 28 6S 断的序列分析结果 . 28 针序列的分析结果 . 29 断分析 . 30 论 . 33 第四章 结论 . 35 参考文献 . 36 致谢 . 45 作者简历 . 46 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 丝状支原体丝状亚种 传染性胸膜肺炎 丝状支原体丝状亚种 丝状支原体山羊亚种 羊支原体 群 7 支原体 羊支原体山羊肺炎亚种 羊传染性胸膜肺炎 联免疫吸附试验 苯二胺 界动物卫生组织 二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳 体结合试验 M 绵羊肺炎支原体 氧核糖核酸 接血凝试验 克隆抗体 合酶链式 反应 联免疫吸附试验 争酶联免疫吸附试验 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 羊传染性胸膜肺炎研究进展 山羊传染性胸膜肺炎 （ 是由山羊支原体山羊肺炎亚种 (引起的山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病。被世界动物卫生组织 （ 列为 B 类传染病，以呈现纤维素性肺炎和胸膜炎为特征。自 1873 年 告在非洲阿尔及利亚地 区发现山羊传染性胸膜肺炎以来，许多国家相继发现之 （ 976） 。我国内蒙古百灵庙地区于 1935 年曾流行山羊的“烂肺病”，绵羊及其它动物不感染 (白文彬等， 2002)。后来又在西北华北内蒙等地有发现。据资料记载此病受感染羊发病率 为 19% 90%，死亡率约为 40% 100%。 亚洲各国引起山羊养殖重大经济损失的主 要原因 （ et 991）（ et 005） 。 原 本病的病原体为支原体科支原体属的成员，典型的急性 病原是 山羊支原体山羊肺炎亚种（ ， 原称生物型 早在肯尼亚分离出来 （ 976） 。 于丝状支原体 簇 中的一种，其中丝状支原体簇包括六个亚型：（ 1）丝状支原体丝状亚种 (C,其代表株为 起牛传染性胸膜肺炎 （ 也可引起山羊发病（ et 989） 。 （ 2 ）丝状支原体丝状亚种 (其代表株 病原体一般引起山羊关节炎，肺炎，败血症（ et 989） 。（ 3）丝状支原体山羊亚种 ( 其代表株 导致山羊发病，多呈肺炎，关节炎 （ 996） 。（ 4）山羊支原体 （ ，其代表株 羊和绵羊均发病，病羊表现为乳房炎，关节炎，败血症。（ 5）牛群 7 支原体 （ ， 其代表株 致牛的关节炎和乳房炎。（ 6）山羊支原体山羊肺炎亚种 （ ，其代表株 起山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病及山羊传染性胸膜肺炎 （ 其中 3 种支原体关系十分密切：丝状支原体丝状亚种 (丝状支原体山羊亚种 （ 和山羊支原体山羊亚种(这三种支原体引起的疾病通常伴有其它器官的损害和（或）除胸 腔外机体其它 部分引起病变 （ et 006） 。 本菌能通过细菌滤器，为一种细小多形性的菌体，丝状长度 10 30体直径大小为 300 500形，同一涂片可见有点状、球状或小环状， 革兰氏染色阴性。 本菌在普通培养基上不生长，在有血清，葡萄糖，酵母液的培养基，例如： 培中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 养基和改良 培养基生长良好，培养基接种后放于 37 培养。平板培养基最好放在含5%二氧化碳、 95%空气或氮气下培养。生长物呈水滴状，大小不等圆形菌落，似“荷 包蛋”样，中间有“脐”。菌落中央呈浅的黄棕色，四周半透明、边缘光滑。在加有血清的马丁肉汤内生长较好，经此培养液传 3 4 代，再在培养基上划板，挑单菌落，可得到 培养物。 本菌有液化凝固血清的能力，能分解葡萄糖，但不能利用精氨酸。对理化因素的抵抗力不强，强毒组织液中加福尔马林 在室温放置 3d，加石炭酸 放置 2d 或 56 40能达 到杀菌的目的。将肺组织保存于 50%甘油盐水中，在 16 下放置 20d 或在 2 5 放置 10d，对山羊仍有致病力，在室温 40d 或在普通冰箱中放置 120d，则失去致病力。 由于支原体是无细胞壁结构的微生物，对作用于细胞壁的抗菌药物： 青霉素、链霉素等不敏感。因此青霉素、链霉素和醋酸铊对本菌抑菌能力低。但本菌对红霉素高度敏感，四环素和氯霉素有较强的抑菌作用。 病原菌在腐败材料中可维持生活力 3d，在干粪中经强烈日光照射后，仅维持活力 8d。 1 的克辽林可于 5杀死本菌。 病羊肺组织的毒力较强，取病肺肝变部分的组织 25 万倍稀释悬液气管注射 染山羊，可引起典型发病。 据外国资料表明，不同品系的病原菌，其免疫原性有差异。印度马德里地方分 离的病原菌具有免疫原性，而从非洲西部分离的病原菌却没有免疫原性 （ et 996） 。在我国不同地区分离的各品系菌株均有免疫原性。 行病学 子流行病学 随着分子生物学技术的不断发展，流行病学也进入分子水平。已公开的丝状支原体簇的基因座 000）， 由 2400基组成，编码一种支原体膜蛋白。 对不同地区的十九种 系进行分析，在 型的 因座上有十一个变化位置，在 三个突变位点，导致 因沉默；在 系中 第二个基因是假基因并且有六个位点的突变导致 达蛋白的不同，通过 酸序列，可将 成四个系统 （ et 002） 。 据 16S 个启动子的基因序列作为流行病学指针，从分子水平上了解 行状况 （ 000） 。 在自然条件下， 本病主要经接触和呼吸道感染，只发生于山羊，尤以三岁以下的最敏感，其它 畜禽不感染 ，有资料报道 有从绵羊 肺 脏中 分离到山羊支原体山羊肺炎亚种 （ et 988） ，中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 也有在骆驼和牛体内发现 原体的报道（ et 988） 。 人工感染山羊一般只限于胸腔和气管注射，皮下注射可引起少数山羊发生体温反应和局部肿胀，但不能引起肺部病变；肌肉注射可引起局部肿胀，呈湿性坏死，最后死亡；静注可引起典型的临床症状和病变；喷雾感染可使一部分山羊在 5 18 天发病，并能引起肺的肝样变；器官注射的潜伏期大多 3 7 天，发病率 95%；接触感染在 20d 后大多数可以发病。人工感染绵羊、兔、豚鼠不发病。 病羊是主 要的传染源，其病肺组织和胸腔渗出液中含有大量病原体，主要经呼吸道分泌物排菌。耐过病羊肺组织内的病原体在相当长时间内排毒。 在冬春枯草季节，羊只消瘦、营养缺乏 以及寒冷潮湿、羊群拥挤等因素，常诱发本病。多呈地方性流行，一旦 该 病在羊群中 发生， 传播 非常 迅速。 新疫区的暴发几乎都是由于引进病羊而发病。发病后，在羊群中传播迅速， 20d 左右可波及全群。冬季流行期平均 5d，夏季可维持 1 个月以上。 病机制 肺炎支原体主要利用其微绒毛黏附在呼吸道上部的上皮纤毛末端并有部分进入呼吸道深部，导致纤毛细胞损伤、死 亡和脱落，而且支原体继续在剩下的纤毛周围生长。引起支气管黏膜及肺泡的轻微炎性 反应，继而病菌穿过管壁顺着淋巴流转移。大量菌体在小叶间隔中繁殖，所以在发病的早期，可见间质炎性水肿及充血明显的淋巴管炎。 邻近的肺膜也相应地有炎性渗出液并显著增厚和发生纤维素性沉积；肺泡壁的毛细血管显著扩张充血，肺泡中聚积多量炎性渗出物，从而引起肝变肺炎灶。在病势发展过程中，肺小叶除见肝变外，支气管黏膜的分泌作用也亢进。另外，由于肺动脉的分枝发生血 栓，进而引起肺组织梗死，病灶邻近的肺小叶间质及肺泡中积聚水肿液。 床症 状 本病的潜伏期，平均 18 20 天 ，最短为 3 6 天 ，最长为 30 40 天 。根据病程和临床症状，分为最急性、急性和慢性三型。 最急性型 病的初期，体温升高达 41 42 ，精神极度萎顿，拒食。呼吸急促，每分钟达 40 45 次。咳嗽，并流浆液带血鼻液；肺部叩诊呈浊音或实音，呼吸极度困难。每次呼吸全身颤动；黏膜明显充血、发绀，目光呆滞，呻吟哀鸣，不久窒息死亡。死前体温下降至常温以下。 急性型 常见病初体温升高，食欲减退，呆立一隅，不愿走路，继之出现短而湿的咳嗽，伴有浆液性鼻漏。 4 5 天 后，咳嗽而有痛感， 鼻液转为黏液 脓性并呈铁锈色，附于鼻孔和唇，结成棕色痂皮垢。听诊有实音区，呈支气管呼吸音和摩擦音。按压胸壁表面敏感、疼痛。当高热稽留不退时，则食欲废绝，呼吸很困难并有呻吟，眼睑肿胀，流泪或有黏液性眼汁，口中向外流出泡沫样口涎。腰背拱起，腹肋紧缩。孕羊大部分流产 (70 80 )，最后病羊卧倒，极度衰弱。有的发生腹胀和腹泻，甚致口腔发生溃烂，唇、乳房等部的皮肤发疹。 急性病例不超过 4 5 天，一般病程 7 15 天，死亡率高达 60% 慢性型 多由急性病例转变而来。全身症状较轻，体温 40 左右。病羊有时 咳嗽和腹泻，鼻中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 涕时有时无，体况衰弱，被毛粗乱无光。如果饲养管理不当，往往造成死亡。一般转归良好。如屠宰检查，可见到肺部和胸壁留有慢性病痕。 理变化 本病的病变多局限于胸腔内脏器官。多在一侧发 生严重的浸润和明显的肝变，其肝变区凸出肺表面，颜色由红至灰不等。 切面呈大理石状；纤维蛋白渗出液充盈使肺小叶间组织变宽，小叶界限明显；支气管扩张，血管内血栓形成。胸腔常有淡黄色液体，多者达 5002000露于空气后，可发生纤维蛋白凝块。胸膜变厚而粗糙，上有黄白色纤维蛋白层附着直至胸膜与肋膜，心包 发生粘 连。心包积液，心肌松弛变软。急性病例还可见肝、脾肿大，胆囊肿胀， 肾肿大，被膜下有小点溢血。 断 山羊爆发性呼吸疾病的诊断，尤其是 比较复杂，特别在流行地区。必须和临床病理学上与其他相似 的综合症区分开来，例如，小反刍兽疫，绵羊也同样易感；巴氏杆菌也容易引起大面积肺损伤而应该 区分开来；还有乳腺炎、关节炎、角膜炎、肺炎和败血病综合症等，顾名思义，肺炎通常伴有其他 器官病变。这些症状又很难与支原体簇中其他病原体引起山羊疾病区分，还需综合以下各方面进行确诊。 原分离与鉴 定 山羊传染性胸膜肺炎 (原 的分离与鉴定向来被认为是一个难题， 丝状支原体簇中的一员，这一簇中有六位成员包括： （ 1） 丝状支原体丝状亚种 (C,其代表株为 起牛传染性胸膜肺炎 （ 。 （ 2 ） 丝状支原体丝状亚种 (其代表株 病原体一般引起山羊关节炎，肺炎，败血症（ et 002） 。 （ 3） 丝状支原体山羊亚种 ( 其代表株 导致山羊发病，多呈肺炎，关节炎。 （ 4） 山羊支原体山羊亚种 （ ，其代表株 羊和绵羊均发病，病羊表现为乳房炎，关节炎，败血症。 （ 5） 牛群 7 支原体 （ ， 其代表株 致牛的关节炎和乳房炎。 （ 6） 山羊支原体山羊肺炎亚种 （ ，代表株 于它们的基因组差异小，有共同的抗原表位，所以 易和其它能引起反刍动物疾病的支原体混淆，而多种支原体引起动物疾病的症状和危害相似， 感染机制和致病原理又非常复杂 （ et 004） （ et 996） ，因此分离 要成熟的技术手段。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 一旦山羊 支原体山羊肺炎亚种 分离到，鉴定工作不会很难，比如用聚合酶链式反应（ ，可以直接从病料中鉴定是否有 分离 到目前为止，分离到病原是证实 生的唯一方法，选择病料对于成功分离 关键，然而分离 一个漫长而困难的过程。 在羊的急性发病期，无菌条件下取胸膜液 10免从病死羊选择病料， 最好的办法是在羊群中找出没有接受过抗生素治疗的病羊，屠杀后取病肺 。其他病料可经胸腔穿刺获得。如取病肺组织，可取正常肺部和病肺交界处，取病料关键是质量而 并非数量 （ et 007） 。 病料可放 运输，最好不超过两天；在 保存数月，而不致使支原体生存能力丧失；如果要超过十个月，最好在 保存。保存病料时加青霉素和链霉素，防止其它 细菌污染。 分离过程中遇到的两大困难：首先， 培养基中生长缓慢；其次，样品极容易受到其它细菌和支原体污染。 首次分离的 长需要 4 5 天，菌落的大小有 落在显微镜下可观察到 ,本实验室将 种传代培养，涂板，观察到 代后菌落呈明显的煎蛋状。在液体培养基培养传代时，呈现轻 微混浊，需要做空白对照管对比观察。 培养基的成分也很关键，一些作者认为新鲜肉浸液有助于支原体生长 （ et 990） ，马血清对培养 常有必要，大致要加到液体培养基总体积的 20% 30%，还有作者建议加牛胎儿血清 （ et 990） 、新鲜的酵母浸出液。本实验室在选择适宜的培养基上做了大量的工作，如加抑制性抗血清，新鲜的酵母浸液，马丁肉汤，一些高效的抑菌剂等，可快速有效的分离 另一个主要的困难是病料极易受到其它细菌和支原体的污染。通常细菌均可被抗生素抑制，如将低 浓度的青霉素和醋酸铊加入培养基抑制细菌的生长。但其它的支原体，比如精氨酸支原体，绵羊肺炎支原体 (M 这两种支原体是上呼吸道的常住菌 （ et 989）（ et 988） ，在正常的肺中也经常分离到，有致病的潜力，对肺有损伤 （