【毕业学位论文】（Word原稿）饲料中喹烯酮的检测方法与鸡粪中喹烯酮及其代谢物的鉴定研究基础兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 饲料中喹烯酮的检测方法与鸡粪中喹烯酮及其代谢物的鉴定研究 of in of in of in of in I 摘 要 自二十世纪四十年代以来，喹噁啉 1,4二氧类化合物作为一类有效的抗菌剂，被广泛用于兽药领域，主要的代表性药物有喹乙醇（ 和卡巴氧 这类药对畜禽有明显的促进生长和抗菌作用。近年来，由于研究表明喹乙醇和卡巴氧具有潜在的致癌危险性而被欧盟禁用于饲料中。喹烯酮（化学名： 32喹噁啉 4这类药物的新成员，是由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制开发的我国具有自主知识产权的一类饲料添加型新兽药。与前两者相比，它具有高效、低毒和添加量少等优点。这对于养殖业特别是畜禽出口乃至人体健康，都具有十分重要的意义。 本项研究内容由两个部分组成：饲料中喹烯酮的分析与鸡粪中喹烯酮及其代谢物的 鉴定。 建立了一种简单快速、专属性强和灵敏度高的反相高效液相色谱法测定 饲料中喹烯酮 的含量 ，以便于合理使用喹烯酮。饲料用乙腈提取，色谱柱： 石 250， 5 ）；流动相：乙腈水（体积比： 45:55），流速为 测波长为 380温 30。收集了上海、北京和四川的多个乳猪和乳鸡饲料进行干扰试验研究。结果表明喹烯酮的质量在 0.62= 40 mg/80mg/200mg/中低三 个不同添加浓度下样品的回收率分别为 为了鉴定鸡粪中喹烯酮及其代谢物，首先采用化学合成法合成制备了可能的代谢物。以喹烯酮作反应原料，低亚硫酸钠（保险粉）作为还原剂，通过薄层色谱法（ 踪反应过程，合成制备得到脱二氧喹烯酮；以喹烯酮为反应原料，三氯化磷为还原剂，合成得到两单氧喹烯酮的混合物，通过柱层析分离得到纯化合物： 1单氧喹烯酮和 4单氧喹烯酮；以苯并呋咱为起始原料，与乙酰乙酸乙酯反应后，经保险粉还原，最终水解制备得到 3甲基喹噁啉 2羧酸。运用红外（ 紫外 (核磁氢谱（ 1电喷雾质谱（ 合成得到的化合物进行了结构认证。 采用液相色谱串联质谱法对鸡粪中喹烯酮及其代谢物进行了鉴定。试验用一月龄健康黄羽鸡只，雌雄对半，以 40mg/剂量单次灌胃给药，收集给药后 0 24 小时内的粪便，采用两种样品前处理方法，高效液相色谱联用三重四极杆串联质谱技术分离鉴定鸡粪中喹烯酮及其代谢物。运用串联质谱全扫描、子离子扫描等多种数据采集模式并结合定向合成的代谢物来确证代谢物的化学结构。试验结果表明，鸡粪便中除了存在原形药物喹烯酮、前期 报道过的代谢物脱二氧喹烯酮和 3甲基喹噁啉 2羧酸外，还存在两个首次发现的新的代谢产物： 1单氧喹烯酮和 4单氧喹烯酮。此方法为进一步深入研究喹烯酮的代谢奠定了坚实的基础。 关键词 喹烯酮，高效液相色谱法，饲料，代谢物，液相色谱串联质谱法 940s, ,4as to of in ,4or in of As a of ,4 3is in It s 990s. in is as of in of of of in A to of in of a 45:55 v/v) as 80 A .6g of in In to in We of R, 1S) to in at a 0g/ in 4 of by of C/S to as 1 4in to S/MS 录 第一章 文献综述与引言 . 1 言 . 1 烯酮的研究 . 1 喹烯酮的物理化学性质 . 1 喹烯酮的药理学研究 . 2 喹烯酮的毒理学研究 . 3 喹烯酮的药代动力学研究 . 4 喹烯酮及其代谢物的检测方法 . 5 喷雾液质联用技术在代谢物鉴定研究中的应用 . 6 电喷雾电离技术的发展 . 6 电喷雾电离的原理 . 6 电喷雾液质联用技术在代谢物鉴定研究中的应用 . 7 论文研究内容与意义 . 8 第二章 饲料中喹烯酮的检测方法 . 10 言 . 10 验部分 . 10 . 材料. 10 色谱条件 . 10 样品前处理 . 11 法认证与结果 . 11 标准曲线与检测限 . 11 精密度 . 11 稳定性试验 . 12 回收率 . 12 专属性 . 13 拟样品测定 . 14 论 . 14 验小结 . 15 第三章 喹烯酮代谢物的合成与结构确证 . 16 言 . 16 验部分 . 17 材料 . 17 代谢物的合成 . 17 合成代谢物的分析 . 18 果与讨论 . 19 化合物 确证 . 19 化合物 确证 . 21 化合物 结构确证 . 27 电喷雾质谱分析探讨 . 30 代谢物合成监测的探讨 . 30 验小结 . 31 第四章 鸡粪中喹烯酮代谢物的鉴定 . 32 言 . 32 验部分 . 32 材料 . 32 给药与采样 . 33 样品前处理 . 33 S 分析 . 33 果与讨 论 . 34 鸡粪便中代谢物的鉴定 . 34 质谱解析探讨 . 39 鸡粪样品前处理的选择 . 39 色谱条件的选择 . 39 质谱裂解碎片探讨 . 40 结肠造口术分别收集鸡的尿液和粪 . 40 喹烯酮在鸡体内可能的代谢途径的推测 . 40 验小结 . 41 第五章 全文结论 . 42 参考文献 . 43 致 谢 . 47 作 者 简 历 . 48 V 图表清单 图 1喹烯酮的化学结构式 . 2 图 1电喷雾的原理示意图 . 7 图 2喹烯酮的标准曲线图 . 11 图 2空白饲料液相色谱图 . 13 图 2喹噁啉 4. 14 图 2喹烯酮的紫外光谱图 . 15 图 3喹烯酮代谢物的合成路线 . 16 图 3红外光谱图 . 19 图 3紫外光谱图 . 20 图 3核磁共振动氢谱 . 20 图 3电喷雾质谱图 . 21 图 3红外光谱图 . 22 图 3红外光谱图 . 22 图 3紫外光谱图 . 23 图 3紫外光 谱图 . 24 图 3B 的核磁共振氢谱 . 25 图 3核磁共振氢谱 . 25 图 3B 的电喷雾质谱图 . 26 图 3电喷雾质谱图 . 26 图 3D 的红外光谱图 . 27 图 3D 的紫外光谱图 . 28 图 3核磁共振氢谱 . 28 图 3D 的电喷雾质谱图 . 29 图 3反应液的薄层色谱图 . 30 图 4S 全扫描的总离子流和提取离子流色谱图 . 34 图 4S 全扫描的总离子流和提取离子流色谱图 . 35 图 4M+H+ M/Z 307 的子离子质谱图 . 36 图 4M+H+ M/Z 291 的子离子质谱图 . 37 图 4M+H+ M/Z 291 的子离子质谱图 . 37 图 4M+H+ M/Z 275 的子离子质谱图 . 38 图 4M+H+ M/Z 189 的子离子质谱图 . 38 图 4喹烯酮及其代谢物的碎片结构 . 40 图 4喹烯酮在鸡体内可能的代谢物途径 . 41 表 2密度试验结果 . 12 表 2定性试验结果 . 12 表 2烯酮饲料样品的回收率测定（ N=3） . 13 表 2- 4 样品测定结果 . 14 3化合物 红外光谱分析结果 . 21 表 3化合物 紫外光谱分析结果 . 23 表 3合物 核磁共振氢谱分析结果 . 24 表 3化合物 核磁共振氢谱分析结果 . 29 表 3应物与产物的 . 31 表 4流动相条件 . 33 表 4喹烯酮及其代谢物的保留时间和 M+H+质荷比 . 35 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 喷雾 效液相色谱 外光谱 S 相色谱质谱联用 谱 S 联质谱 磁共振 离子流色谱 层色谱 外光谱 取离子流色谱 第一章 绪论 1 第一章 文献综述与引言 言 自二十世纪四十年代以来， 喹噁啉 1,4二氧类化合物作为一类有效的抗菌促生长剂，被广泛用于兽药领域（ et 2005; 981）。其中最有代表性的药物有德国拜耳公司研制的喹乙醇（ 、 美国辉瑞公司研制的卡巴氧 on 1990; 1990)和由中国农业科学院兰州畜牧和兽药研究所研究开发的痢菌净（又名乙酰甲喹， 。这类药对畜禽有明显的促进生长 (1969)和广谱的抗菌作用 (978)，通过抑制细菌 成，对禽巴氏杆菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌以及痢疾杆菌都有很好的疗效 (2000)。这类兽药能在动物体内参与 蛋白的同化作用，这种蛋白同化作用的结果，促使更多的氮贮存，从而使畜禽生长更多的瘦肉，在提高畜禽对饲料的消化能力，促进生长发育，提高饲料的转化率方面具有显著作用。近几年来，一些养殖户片面追求经济利益，滥用喹乙醇等喹噁啉二氧化物类饲料添加剂：超剂量使用或饲喂时间过长，甚至将其当营养添加剂来使用，从而引起畜禽蓄积性中毒（ 邓云波 ， 2004）这不仅影响了我国的畜产品的出口，而且影响人民的身体健康，威胁人类的生命安全。随着毒理学研究的深入，科学家发现卡巴氧和喹乙醇对动物有潜在的致癌和致突变的危险（ 1981; 1980; 1975） 。因此欧盟于 1998 年发文禁止在饲料中添加喹乙醇和卡巴氧 (of 1998)。 鉴于此种情况，非常有必要开发一种安全性高的替代产品。 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所的科研人员经过多年的努力，已成功开发出了具有自主知识产权的新兽药 喹烯酮。它是喹噁啉 1,4二氧类化合物家族的新成员，它除了具有这类药共有的抗菌和促生长作用的特点外，还 具有喹乙醇和卡巴氧无法比拟的高效、低毒和添加量少等优点（邹仕庚， 2005）。因此新药喹烯酮的成功开发，对我国乃至全球的畜牧业发展都具有非常重要的意义。 烯酮的研究 喹烯酮的物理化学性质 喹烯酮（ , 化学名为： 3- 甲基 桂酰基 - 喹噁啉 4- 第一章 绪论 2 （ 3属于喹噁啉 4品为黄色结晶性或无定形粉末。无嗅、无味。分子式： 子量： 品微溶于甲醇、乙醇；在氯仿、二氧六环、二甲亚砜中溶解。熔点为 熔融时，同时分解。对光敏感，应避光保存。 图 1喹烯酮的化学结构式 of 喹烯酮的药理学研究 喹烯酮的抗菌促生长作用依赖于其分子的化学结构，它的母核结构为喹噁啉 4 2此生物活性也有很大差异，保留 了其抗菌促生长作用，毒性却大大降低。喹烯酮的作用机制与喹乙醇和卡巴氧的大体相似，即喹烯酮可选择性抑制肠道致病性大肠埃希氏菌，但不影响有益大肠埃希氏菌和其它革兰氏阳性菌，故能有效地控制仔猪腹泻和禽巴氏杆菌病等，喹烯酮抑制肠道内的有害菌而保持其中的有益菌群，可增加饲料营养的消化吸收能力，有利于促进机体生长。 徐忠赞等（ 1995）进行了 10 批仔猪添加喹烯酮的增重效果试验。结果表明，在 30 60 天的的饲喂期内，与对照组相比， 50mg/烯酮组多增重 75mg/多增重 10 批试验的平均增重比对照组高 试验组的饲料效率比对照组提高 与喹乙醇组相比，在 3 批对比试验中，喹烯酮组有 2 批增重高于喹乙醇，分别高出 有 1 批低于喹乙醇组 试验期间，喹烯酮组仔猪腹泻的发病率仅为对照组的 32% 49%。 王玉春等（ 1995）在饲料中分别添加 25mg/50mg/ 75mg/个不同剂量的喹烯酮和喹乙醇对肉仔鸡进行了饲养试验，结果表明， 50mg/75mg/量组的喹烯酮和喹乙醇均能显著促进肉仔鸡 生长，其中以 75mg/量组最佳。与空白对照组相比，喹乙醇的增重率为 用 75mg/量的喹烯酮作扩大试验，共进行了 9 批， 第一章 绪论 3 与空白对照组相比，平均增重率为 117%，死亡率降低 饲料效率提高 12%。 喹烯酮的毒理学研究 烯酮的一般毒理学研究 王玉春等对喹烯酮进行了全面系统的一般毒理学研究，包括急性毒性研究（王玉春等， 1992）、蓄积毒性研究（王玉春等， 1993）、亚急性毒性研究（王玉春等， 1994）和慢性毒性研究（ 1994）。 急性毒性的研究结果表明，大白鼠 8178996重 )，小白鼠的 重 )，均在实际无毒级范畴 (实际无毒大白鼠口服 :5000 15000 重）。 在蓄积毒性试验中，王玉春等选用 1/20、 1/10 和 1/5 种剂量给小白鼠连续灌胃 20 天，继续观察 7 天，结果小白鼠全部存活，毛顺而光泽，生长正常，均比对照组多增重 2g， 10 天后剖检观察无异常变化，表明喹烯酮在小白鼠体内无明显的蓄积作用。 在亚急性毒性实验中，王玉春等分别在 饲料中添加 50mg/75mg/100mg/150mg/00mg/个浓度的喹烯酮饲喂大白鼠和小白鼠，经过 90 天的饲喂，结果显示大白鼠和小白鼠均未出现异常。 在进行慢性毒性研究时，他们分别在饲料中添加 75mg/150mg/ 300mg/个不同浓度的喹烯酮饲喂昆明小白鼠，试验期为 20 个月，得出的结论是：小白鼠死亡数明显低于空白对照组，差异显著（ p ,且色谱峰型对称。 第四章 鸡粪中喹烯酮代谢物的鉴定 40 质谱裂解碎片探讨 喹烯酮及其代谢物（除了 3喹噁啉 化学结构上具有高度的类似性（见图），从这些化合物的子离子质谱图也能证明这一点，对各化合物的准分子离子 M+H+的子离子质谱分析发现其质谱断裂方式存在共性（图 4 m/各化合物都有的碎片离子；除了脱二氧喹烯酮外，其他几个化合物都共有碎片 m/此之外，喹烯酮和 1m/143 和 197。 图 4喹烯酮及其代谢物的碎片结构 4of 结肠造口术分别收集鸡的尿液和粪 本论文在最初的论文设计时考虑过分别检测鸡的尿液和粪中的喹烯酮及其代谢物以进行喹烯酮在鸡的肾脏和肝脏的代谢与排泄研究。由于鸡本身没有膀胱，尿和粪都排入泄殖腔，难以采集到干净的尿液和粪。因此我们根据文献（郭小权等， 2004）对 4 6 周龄的黄羽鸡进行结肠造口术以分别收集鸡的尿液和粪。手术进行了两次，三天的存活率都在 75%以上，但一周的存活率都为 0。由于此手术的存活率低很 难进行给药后的鸡尿液和粪的分别收集。因此实验放弃了此方案，最后采用现在的实验方案。 喹烯酮在鸡体内可能的代谢途径的推测 根据以上研究结果，我们对喹烯酮在鸡体内可能的代谢途径作了推测，见图 4果发现，其与其他喹噁啉 4 z 2 4 5m / z 1 4 3m / z 1 5 9m / z 1 3 1m / z 1 9 第四章 鸡粪中喹烯酮代谢物的鉴定 41 2004)都是先还原脱去一个配位键的氧形成单氧化合物、接着还原再脱去另一个配位键的氧形成脱二氧化合物，最后经过氧化水解生成代谢物喹噁酸类化合物。 图 4喹烯酮在鸡体内可能的代谢物途径 4of in 验小结 本实验通过液质联用法鉴定了鸡粪中的喹烯酮及其代谢物，通过与合成代谢物对照证实，鸡粪中除了含有原形药物喹烯酮外，还存在四个代谢物： 14二氧喹烯酮和 3喹噁啉 中 14此基础上推测出了喹烯酮在鸡体内可能的代谢物途径。 O O HR e d u c t i o nh y d r o l y s i sR e d u c t i o 业科学院硕士学位论文 第五章 全文总结 42 第五章 全文 结论 采用液相色谱法建立测定饲料中喹烯酮含量的分析方法。方法简单、实用，经过方法认证，各项指标都符合要求。 通过化学合成制备了喹烯酮的四个代谢产物，经红外、紫外、核磁共振氢谱和电喷雾质谱确定四个化合物分别为脱二氧喹烯酮、 14喹噁啉 采用液质联用鉴定鸡粪中的喹烯酮代谢物，结果显示，喹烯酮在鸡体内可代谢成多个代谢产物：脱二氧喹烯酮、 14喹噁啉 中 14鸡体内发现。 推测出喹烯酮在鸡体内可能的代谢物途径：先还原脱去一个配位键的氧形成单氧化合物、接着还原再脱去另一个配位键的氧形成脱二氧化合物，最后经过氧化水解生成代谢物 3喹噁啉 参考文献 43 参考文献 1. 古利， 喷雾质谱应用技术北京：化学工业出版社， 2005： 11. 邓云波，段苏华，陈启友 . 喹乙醇的特性及其规范合理使用 J. 河南畜牧兽， 2004， 1：14. 郭小权，唐建霞，黄克和，侯加法 指标和尿沉渣的研究 J2004， 35(1)： 6. 金录胜 法测定喳烯酮及其制剂含量 J. 中国兽药杂志， 2003， 37(5)： 25. 李慧义，罗淑荣 国外医学药学分册， 1997， 24(5)： 257. 李剑勇，李金善，徐忠赞，杜小丽，苗小楼，赵荣材，柳军席，薛飞群 . 喹烯酮在猪、鸡体内的药代动力学研究 J. 畜牧兽医科技， 2002， 34(1)： 94. 李剑勇，李金善，徐忠赞，赵荣材，苗小楼，张继瑜，鲁润华 J. 动物医学进展， 2004， 25(4)： 117. 李剑勇，李金善，徐忠赞，赵荣材，苗小楼 . 高效液相色谱仪检测猪组织器官喹烯酮残留方法的建立 J. 中国兽医科技， 2003， 33（ 8）： 48. 李剑勇，赵荣材，李金善，柳军席，徐忠赞，杜小丽，苗小楼，薛飞群 . 喹烯酮在猪体内的药代动力学研究 J. 中国兽医科技， 2001， 31(8)： 310. 李剑勇，周绪正，李金善，赵荣材，苗小楼，张继瑜，张萍 . 氚标喹烯酮在鸡体内的代谢动力学研究 J. 毒理学杂志， 2005， 19(3)增刊： 273 11. 梁晓东 2002， 23(4)： 2342. 苗小楼，徐忠赞，薛飞群等 J. 中兽医医药杂志， 2000， 3： 41. 13. 苗小楼，徐忠赞 . 紫外分光光度法喹烯酮及其预混剂 J. 中兽医医药杂志， 2000， 19（ 3）：41 14. 宋振玉主编 法、应用 人民卫生出版社， 1990 15. 王艳春 . 用 检测饲料添加喹烯酮中的有关物质 J. 中国兽药杂志， 1999， 33（ 1）：256. 王玉春， 薛飞群，