【毕业学位论文】（Word原稿）用基因芯片技术分析水稻白叶枯病菌侵染过程的基因表达图谱植物病理博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 用基因芯片技术分析水稻白叶枯病菌 侵染过程的基因表达图谱 of in of in I 摘 要 水稻 白叶枯病是由水稻 黄单胞 细菌 水稻变种 （ 称 起的 、严重危害世界水稻生产的 最重要的细菌病害之一。 近十年来，对 病相关基因的研究，大大增加了人们对其致病机理以及与水稻互作分子基础的认识。虽然已经从 鉴定出了几十个致病相关基因，但由于 水稻之间的互作关系以及致病 机理比较复杂，许多毒性和无毒机制至今仍不清楚。对 病机理以及与水稻互作分子过程的解析，将为发展新型、有效和可持续的病害控制策略和方法提供科学依据。最近公布发表的 基因组序列，为人们全面和系统地开展 因组学研究提供了前所未有的机遇。同时，基因芯片技术也是近年来新发展起来的基因组整体研究技术，具 有快速、高效和高通量的特点，目前已被广泛地应用于基因表达水平检测等方面的研究，正在逐渐成为植物病原菌致病机理的功能基因组学研究的主要方法之一。 本研究利用基因表达芯片技术，分析了 株 ）在与水稻（感病品种日本晴）不同互作条件下的基因表达图谱，鉴别了一批重要的差异性表达的细菌基因。这是有关 水稻互作及其功能基因学的创新性研究课题之一，至今在国内外尚未见到类似报导。 首先， 研制了 基因芯片，建立了相应的芯片制备技术体系。利用新发表的 及近似种病菌的全基因组序列，建立了基因组序列 本地数据库，选择了 病相关基因、特有基因、调控因子基因以及植物病原细菌的保守基因，用于基因芯片的构建。成功地研制了一批载有 371个 异性片段的基因芯片，探索了基因芯片制备过程中的方法要点，建立一套规范的基因芯片制备技术体系。 第二，建立了模拟 染水稻初期的体外系统，并成功用于对侵染初期 因表达图谱的研究。结果表明，与水稻离体叶片互作后 15 有 50 个基因上调表达，有 6 个基因下调表达。 第三，探索出对发病水稻植株内 行基因表达图谱分 析的方法，获得了 接种水稻后 7 d 和 10 d 的基因表达图谱。结果表明， 染水稻叶片后 7 d， 38 个 基因上调表达， 29 个 基因下调表达 。 染水稻叶片后 10 d， 76 个 基因上调表达， 9个 基因下调表达 。 第四，设计了可覆盖 基因组的 物，并用于对接种水稻后 1 d、 3 d 和 7 d 的 果表明， 染水稻叶片后 1 d， 43 个 基因表达上调， 35 个 基因表达下调 。 染水稻叶片后 3 d， 73 个 基因表达上调， 37 个 基因表达下调 。 染水稻叶片后 7 d， 54 个 基因表达上调， 24 个 基因表达下调 。 本研究通过基因芯片技术对 水稻互作过程中的基因表达图谱进行分析，在理论上初步揭示了 些基因（己知和未知功能基因）的表达特征和规律，识别了一批新的具有潜在致病功能的细菌基因 ； 在技术和方法上， 建立了一套用基因表达芯片研究病菌侵染组学的技术平台和实验体系。本研究结果为进一步开展 及其它植物病原细菌致病性的功能基因组学研究奠定了基础。 关键词 水稻白叶枯病菌；基因 芯片；基因表达图谱；致病机理 is of in In of of oo by of of in of oo oo is of of on of be oo oo oo on a is of NA is of NA it to is a to In ) of an oo so NA on of oo of oo as in NA in NA 71 NA an in to oo in IV to oo of 0 oo 5 to in d 0d 8 9 d 76 0 d on oo to in d, 3d d 3 5 d 73 7 d 54 4 d In by of of of to NA to of oo V 目 录 第一章 绪论 . 1 1 水稻白叶枯病菌致病性的分子机理 . 1 因组的总 体特征 . 2 全基因组序列比较 . 2 动组分 . 3 谢特征和 统 . 3 病相关基因 . 4 2 基因芯片的制备技术 . 13 因芯片的种类 . 13 片点制的表面工艺 . 15 3 基因芯片在植物病原物互作研究中的应用 . 18 物抗病反应 . 18 用基因芯片研究植物 病原物互作 . 19 片数据与己知植物防卫信号途径的相关性 . 23 4 病原细菌基因表达图谱的研究 . 27 学病原细菌的基因表达谱 . 27 物病原细菌的基因表达谱 . 30 5 本研究的目的意义及技术路线 . 31 第二章 材料与方法 . 33 1 实验材料 . 33 要仪器设备 . 33 要试剂 . 33 他试验材料 . 34 株与植物材料 . 34 养基 . 34 2 试验方法 . 34 片的构建 . 34 品的处理与探针的制备 . 46 交 . 53 交结果数据分析 . 57 第三章 结果与分析 . 58 1 芯片的构建 . 58 因的选择 . 58 物设计 . 58 增 . 58 因芯片制备条件的优化 . 59 2 样品的处理与探针的制备 . 60 同条件下 提取 . 60 基因组 物的设计 . 60 芯片杂交结果 . 60 机引物标记的结果 . 60 物标记的结果 . 68 第四章 讨论 . 77 1 建构 因芯片及其技术体系的作用和意义 . 77 2 水稻离体叶片互作 15 的基因表达变化 . 78 3 接种后 7d、 10d，水稻植株内 因表达变化 . 81 4 物与随机引物标记方法比较 . 83 第五章 结论 . 84 参考文献 . 86 附录 . 101 致 谢 . 145 作者简历 . 146 文缩略词 英文缩写 英文全称 中文名称 毒基因 敏性反应和致病性基因 II 蛋白分泌系统 放阅读框 RM 制 IS 入序列元件 基高丝氨酸内酯 苷酸结合序列 含亮氨酸重复区 定位信号 等基因系 外多糖 多糖 般分泌途径 病岛 签诱变技术 in 内表达技术 于基因组的引物 因水平转移的事件 性氧中间体 SA 杨酸 NO 氧化氮 烯 JA 莉酸 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 1 水稻白叶枯病菌致病性的分子机理 水稻 白叶枯病（ of 是由 水稻黄单胞 细菌 水稻变种 （ 染引起的、 严重危害水稻生产的细菌性病害之一。 近 三 十年来， 随着许多高氮水稻品种大面积推广应用，水稻 白叶枯病不仅已成为亚洲等水稻主产区的主要病害，而且在澳大利亚、非洲、拉丁美洲以及北美洲都有该病害的发生 （ et 1995; 1993）。 我国每年因为此病造成的水稻产量损失在 10以上 （ 方中达， 1990） 。水稻 白叶枯病是一种维管束病害 ，在自然条件下， 常由水孔或伤口 侵染， 进入 木质部，在其中繁殖，并向导管移动。一旦进入导管， 不断增殖，直至导管被菌体和胞外多糖、黄原胶堵塞。如果在苗期或者分蘖早期侵染，将会造成稻苗的萎蔫。如果是在后期侵染，病斑将会沿着叶脉扩展，并逐渐变成灰绿色至黄色。 水稻 发病后 ，一般减产 20， 在为害严重的田块，可以造成 50%的减产（ 2000）。 种植抗病品种是生产上控制水稻白叶枯病的主要措施。但因 病性的变异和新毒性 群体的出现，往往使经过数年培育的抗病品种在推广种植几年后就丧失了抗病性 （ 1996） 。 从经济的角度上考虑，水稻白叶枯病是水稻上的一种重要病害，因此在病害诊断、病菌分离、流行学及病害防治方面都已有大量研究。另外，根据 X. . 酸钠利用、菌体全蛋白、脂肪酸侧链类型、寄主植物种类、寄生方式和致病表型等方面的差异，认定 2002） 。 近年来，通过对们对 表性的基因群有效应蛋白基因、无毒基因（ 、过敏性反应和致病性基因（ 与胞外多糖和细胞壁降解酶产生有关的基因等。在植物病原细菌中，由 II 非寄主或抗性寄主上激发防卫反应和感病寄主上的致病性中起重要作用（ 1997）。一些 测其功能是形成通道运输效应蛋白如无毒因子进入植物（ 2000）。除了 木聚糖酶）等其它毒性因子时起作用（ Xu 1989; 2000），与胞外多糖的合成有关的 999）。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 病原菌的基因组序列测定是了解致病机制和限定寄主范围机制的非常重要的一步。已经测定了几个植物病原细菌的全基因组序列如 et 2001）、et 2003）、 et 2002）、 et 2000）和两种 et 2002）。在 经报道了 X. 柑桔溃疡病菌）和 X. 甘蓝黑腐病菌）的全基因组序列。从这些基因组序列中已经推测出了与致病性相关的基因，例如由细菌产生的可以转移的效应蛋白，以及与其它生物学过程有关的基因。因为水稻与其它种黄单胞病菌的寄主在分类上明显不同（单子叶植物而非双子叶植物）， 稻的互作。随着 et 2005）的全基因组序列和结构的公布和发表，为从基因组水平上了解 因组的总体特征 小为 4,941,439有自主的质粒。基因组 G+比 ， 和 R. 基因组 G+是比其它植物病 原细菌 X. ， A. 5860%）和 P. 的基因组含量高。基因组大部分为编码序列，推测其包含 4,637个编码多肽的 据已知的 者序列相似性）可以对其中的 3,340个（ 推测的基因分配功能。剩余的1,297个基因（ 可能表达未知功能的蛋白。复制起始位点由 于 5034的编码基因和推测表达 时鉴定出两组独立的 23S56S 组由 2个操纵子组成。另外还发现了可以识别 54个密码子的 （ et 2005） 全基因组序列比较 现在 向匹配），许多重排发生在复制起始位点附近。通过 发现了一些直向匹配。 是对角线匹配。 列比较发现有 3个主要的重排：一个是在复制终点附近的翻转，另外两个是对称的位于复制起点随转座发生的翻转（ et 2002）。 将整个基因组与已报道的 因组序列进行比较，发现中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 了 45个种所特有的基因，它们在 中 95个基因编码功能性蛋白，150 个是未知功能的（ et 2005）。 修饰（ 素产生（ 且， et 2004） 。 动组分 在 个插入序列（ et 2000; et 2002; 2000; et 1990），在09和 108个转座成分。 478个 271个与转座酶基因具有很高的相似性，表明它们在基因的水平转移和基因组的内部重排中起重要的进化作用。 07个基因与可移动的遗传组分有关。包括在 座子和 37个明显的原噬菌体相关基因。 个已知的 1989; et 1987） 。 207个 17个拷贝。在 6个拷贝（ et 1999），然而，在 中一个成员（ 21个拷贝，以前没有在 多 不同的密码子， G+明这些基因可能是通过水 平转移获得的。在噬菌体也可以导致进化以及毒性因子和其它性状基因的水平转移（ 2003）。在 2000）。在 现了一个噬菌体相关的基因簇（ 27码了尾蛋白、整合酶、衣壳、裂解酶和复制酶，几乎完整的原噬菌体。这个基因簇与 而 它在 个假设蛋白。因此， 7497%） 。 是 7796%） （ et 2005）。 谢特征和 统 分子和 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 定出具有吸收和转化硝酸盐和亚硝酸盐成为氨基酸的基因（ 3个拷贝）和 2个拷贝），表 明 可以协助小的多肽进入。表明 多细菌可以通过细胞间的通讯系统感受它们的种群密度，当其种群达到一定阈值时，可以改变特定基因的表达。这种现象称为群体感应（ et 2003） 。植物病原细菌 A. E. . 用酰基高丝氨酸内酯（ 节一些毒性基因。尽管 是信号感应和调节的动态规律在本质上很难定义，而且目前正不断出现新层次上的复杂性。例如，不同的细菌产生不同的 一种菌也可能产生不止一种 知 418碳 ） ，可以包含双链，或者在 1999; et 2001）。另外，群体感应调节可能是菌株特异的，不同的菌株产生不同的 者根本检测不到 et 1988; et 2001）。在 现了乙酰化作用、 是与 在 个 1994; et 1998）。在 个 别是 外，还存在 3个 病相关基因 植物与病原物互作的结果决定于各自所带的基因。在多数情况下，寄主编码的抗病基因 （ R）产物识别由病菌编码的无毒基因 （ 产物，这种互作触发一个快速的防卫反应， 即非亲和反应，病原菌被限制在初侵染位点。病菌 因只有在 因参与时才能诱发植物产生非亲和反应。 当病菌中缺少合适的 因或者寄主植物中缺少 R 基因，都将会导致亲和性互作，这种情况下， 病菌通过向植物分泌胞外酶 、 胞外多糖及其它致病因子 ， 克服植 物固有的防卫机制，使植物发病。 现已确定了 大约 30个水稻抗白叶枯 病 基因，有 5个已经克隆 2004; Gu et 2005） 。 其编码的蛋白在 序列上包含一个 核苷酸结合序列 （ 富含亮氨酸重复区（ 能引起水稻对 的抗性（ et 1998）。 第一章 绪论 5 组成性表 达基因，编码蛋白具有一个位于胞外的 引起水稻对 的抗性（ et 1995）。 码 113个氨基酸。除了水稻，在其它生物中没有发现与 Gu et 2005） 。其中目前仅有 而其它 于 各个 结构 存在较大 差异， 相对应的 的差异可能也比较大 。 在 已报道的 个已知的 中有 4个有两个 . 些基因与 et 2005）。 属于黄单胞菌中最早克隆的无毒基因 族（ et 1989; Gu et 2005）。此家族基因最大的特点是其编码的蛋白中部有一个由 34个氨基酸组成的重复 单元 ，重复的次数在不同的基因中不同，但每个重复 单元 的氨基酸除第 12和 13 位外 ， 其它位点都是很保守的，