【毕业学位论文】（Word原稿） 欧文氏杆菌CXJZ95-198非纤维素降解特性及manA基因的克隆研究生物化学与分子生物学博士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 博士学位论文 欧文氏杆菌 纤维素降解特性及 因的克隆研究 5ts 5ts 摘 要 生物法提取草本纤维能有效降低化学方法对环境造成的严重污染，降低生产成本，提高产品质量，是草本纤维利用的发展方向。甘露聚糖酶在非纤维素降解 中具有重要作用，在造纸、纺织、食品、医药、石油等领域具有广阔的应用前景。 198 是迄今报道草本纤维提取效率最高的菌种。本文对该菌种的单糖利用、草本纤维提取过程中非纤维素物质脱除规律与方式等进行了深入研究；并对其 因进行了克隆、生物信息学分析与表达研究。结果如下： 该菌株嗜好甘露糖，使精制苎麻纤维中不含甘露糖， 甘露聚糖酶在该菌株 的草本纤维原料生物提取过程中发挥了重要的作用。 草本纤维原料接种 该菌种 后，通过 非纤维素物质培养菌 酶降解非纤维素物质 的螺旋式 生化反应，降解非纤维素物质 。草类原料发酵液糖类、不溶性有机物等在发酵 6 8到最高 ,发酵液中大分子和 不溶性物质占有机质总量的 90以上 ,发酵过程可以脱除草本纤维原料重量 8 11的非纤维素物，能使原料中的非纤维素物质发生块状崩溃而脱落。进一步证实了刘正初先生提出的“块状崩溃”假说。 采用优化的 分酶切条件，获得 2 5断 ,直接用来构建基因组文库，获得15000 个转化子，筛选到了 8 个阳性克隆。选取 子量最小的 粒测序，获得了包含 因、长度为 1844断的 全碱基序列。 析表明这 8 个阳性克隆含有相同的 因。 初步确定了 因组 序列位点 4449729 游 是 因。这是首次明确欧文氏杆菌基因组该位点的功能。 本 因的 1137其它来源的 因同源性很低，是一新 因。 8 位存在 列。该基因已登陆 陆号为 本 因编码含 378 子量 蛋白质。可能在 N 端存在 27 信号肽。该蛋白的结构以螺旋（ 35）和无规则卷曲（ 为主，具有两个结构域， N 端为催化域，胞外蛋白，属糖苷水解酶第 26 类。 本 与其它来源的甘露聚糖酶 列存在一定的同源性，与芽孢杆菌甘露聚糖酶 50 52），与其它来源的甘露聚糖酶 似性低（ 30）。 成功构建了 达载体并对其表达调控进行了研究。信号肽对蛋白质的分泌具有重要意义。度与诱导时间、诱导温度对 表达都存在明显影响。随着 度的提高，胞外甘露聚糖酶活力逐步提高，最适 浓度为 1导温度较高时（ 37），诱导效果更加明显。在 导的情况下，有信号肽载体能同时强表达分子量 42右的目标带与 47右的另外一条帯，无信号肽者只表达一条目标蛋白带。 该甘露聚糖酶的最适底物为葡萄甘露聚糖，最适 为 适温度为 50。 该研究明确了本菌种草本纤维高效提取机理，克隆到了一个新 因，明确了 449729 游 1300点功能。 关键词 E. 纤维素降解 ,因 ,克隆 I is in of in be in 5is of of in Its to is of in of in be by in of be in 90% of in to be in -5 kb be 8 5,000 844bp It It of ,449,729 is is to of 137RF is of to Its a is no of a D on 8. is 87 AA of A 7 is 5% a be Its an as 6. of of 00%. is of to of mM 7 . W 2 7 KD of be be no pH .5 0 目 录 第一章 绪 论 1 究的目的和意义 1 物法提取草本纤维是国内外生物质产业的发展方向 . 1 株提取草本纤维表现出广谱性和高效性 . 1 露聚糖的分子结构与降解 . 2 露聚糖酶的应用前景十分广阔 . 3 内外甘露聚糖酶研究现状 . 4 露聚糖酶的来源 . 4 露聚糖酶的性质 . 6 露聚糖酶的分类、结构分析 . 7 露聚糖酶表达条件的优化 . 8 内外甘露聚糖酶基因的分子遗传学研究现状 . 9 露聚糖酶基因克隆 . 9 露聚糖酶基因的结构分析 . 9 菌种的 基因组学研究现状 . 10 第二章 198 非纤维素降解特性研究 11 验材料与方法 . 11 验材料 . 11 验方法 . 11 验结果 . 12 营养特性 . 12 料发酵过程中有机物的变化规律 . 13 料加工过程中的重量变化规律 . 16 物脱胶苎麻精干麻中非纤维素物质残留量 . 17 论与讨论 . 18 本纤维生物提取工艺的基本特征 . 18 块状崩溃 ” 假说的基本内涵 . 19 露聚糖酶是 “ 块状崩溃 ” 假说的关键因子 . 19 第三章 露聚糖酶基因的克隆与表达 20 实验方法和材料 . 20 验材料 . 20 V 验方法 . 21 验结果 . 26 因组 分酶切的条件优化 . 26 性克隆的鉴定 . 29 露聚糖酶基因的 列 . 31 露聚糖酶基因的序列分析 . 37 达载体的构建 . 41 达载体的序列鉴定 . 42 同表达载体的表达情况研究 . 43 同 度与温度对表达的影响 . 45 组甘露聚糖酶的酶学研究 . 47 论与讨论 . 48 第四章 结 论 51 参考文献 54 致 谢 62 附 录 63 附录 (. 63 附录 因组 4449335 444967 序列的编码情况 . 68 附录 3. 所克隆基因 陆号与序列 . 69 附件 4：结构域预测 . 71 附件 5： 列测定 . 72 附件 6： 列测定 . 73 附件 7： 列测定 . 75 附件 8： 列测定 . 77 作 者 简 历 79 英文缩略表 （ 英文缩写 英文全称 中文名称 基酸 苄青霉素钠盐 基对 维素结合域 码区序列 学好氧量 代十六烷基三甲胺 文氏杆菌 儿顿 重蒸馏水 氧核糖核酸 化乙锭 二胺四乙酸 钠盐 g of 力加速度的倍数 g 时 丙基 道儿顿 芋葡苷聚糖 B 培养基 豆胶 露聚糖酶基因 露聚糖酶 I 克 钟 升 摩尔 美国 国家生物技术信息 中心 密度 放阅读框 合酶链式反应 分钟转速 s D 序列 二烷基磺酸钠 胶电泳 羟甲基氨基甲烷 U 活力单位 g 克 l 升 M 摩尔 X 43 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 究的目的和意义 物法提取草本纤维是国内外生物质产业的发展方向 麻类等草本纤维的开发利用在解决人类面临的森林资源枯竭 ,生态环境恶化问题 ,提供多样性产品等方面具有重要作用，世界各国对此高度重视（李宗道， 1980；中国农业科学院麻类研究所， 1993）。 目前，国内外利用麻类等草本纤维资源开发出了许多可替代森林和石油基制品的新产品，例如，各类高档服饰、可降解膜 （王朝云等， 2005）、 纸品 、 密度板（型）材 、复合高分子材料 等 ,其产业态势正在国 内外蓬勃兴起。 但麻类等 草本纤维原料 在利用之前 ， 大 都需要经过一个复杂的初级加工过程，即 去除非纤维素的纤维提取与精制过程 。目前，国内外普遍采用的草本纤维提取 与精制 方法几乎都是以烧碱蒸煮为中心的化学方法。常规化学方法的基本原理是利用纤维素分子与非纤维素物质对酸、碱、氧化剂等化学试剂的稳定性差异，来 达到 降解非纤维素物质 、 保留纤维素的 目的（李宗道，1980）。 它存在三个严重制约着草本纤维产业发展 的 突出问题：一是成本高、能耗大，二是纤维流失多且结构受到损伤，三是环境污染严重 （ , 2004；郝利民， 1983） 。 为了解除草本纤维产业发展的制约因子， 近 50 多年 来，国内外广泛开展了生物技术在草本纤维提取过程中的应用研究。到目前为止，只有中国农业科学院麻类研究所在国内外率先发明的 苎麻生物脱胶工艺技术与设备 (刘正初， 1996)和 高效节能型龙须草生物制浆技术 等成果在工厂化条件下应用获得了成功 （ ,2004）。 与化学方法 相 比，生物法提取与精制草本纤维 具有以下优势： （ 1）工艺辅料投入减少 60%；（ 2）能耗节省 35%以上 ；（ 3）精制纤维产量提高 （ 4）无机和有机污染物排放量分别减少 60%和 50%（ 004） 。由此可见，生物法提取草本纤维可以克服常规化学方法存在的弊端，是发展草本纤维产业的关键所在。 株 提取草本纤维 表现出广谱性和高效性 草本纤维提取过程一般需要除去占草本纤维原料重量 22%非纤维素物质，包括果胶（ 4 8%）、半纤维素（ 12 18%）、木质素（ 2 5%）等物质 (998；李宗道， 1980)。这些物质镶嵌于细胞之间及细胞壁中，结构十分复杂 （ ， 1998； ,1988;1997）， 甘露聚糖及木聚糖是纤 维素与木质素连接的重要桥梁，它常以共价键的方式与纤维素连接，以氢键或其它非共价键的方式与木质素连接 ( ,1988; ,1997;1999)。国内外大量研究表明，所选育出来的天然菌株或经过诱变、基因改造而获得的突变菌株分泌酶的种类和数量不能满足降解键合型非纤维素物质的工艺要求，无论果胶酶的活性有多高，采用活菌发酵或酶制剂处理都只能除去少量非纤维素物质，必需化学方法予以弥补，这就形成了 生物化学联合脱胶 等所谓的生物脱胶（包括酶脱胶）或生物制浆工艺 （孙庆祥等，1981） 。 刘焕明等研究表明 ，采用果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶分别处理以及采用 3 第一章 绪 论 2 处理苎麻 6后，苎麻残胶量还有 20%以上，也就是说，酶处理对非纤维素物质的除去率还不到 30%(刘焕明等， 2006)。研究还证明，要使果胶降解，需要 9 种果胶酶的联合作用 (邝利民 ,1983，张运雄等， 2003)。因此，可以肯定，生物法提取草本纤维几乎不可能采用一种或几种酶在同一反应体系中彻底降解全部键合型非纤维素物质。 刘正初等 选育了 一个 广谱性 、 高效性 的欧文氏杆菌突变菌株 198， 将该菌株活化态菌液接种到 苎麻、亚麻、红麻韧皮、龙须草、 罗布麻、 麦草等草本纤维原料上，通过 非纤维素物质培养菌菌分泌酶酶降解非纤维素物质 的螺旋式生化反应 6 8 定向爆破 果胶、半纤维素及部分木质素等非纤维素物质分子结构，使之发生 块状崩溃 （ ,2003；刘向华等， 2004；周裔斌等， 2002， 2003） ，经过温水洗涤，可以除去 90以上的非纤维素物质，由此形成了系列具国际领先水平的原创性发明专利和鉴定成果 (刘正初， 1996， 2003，003)。笔者 与李宝 秀山等 发现， 株 能 分 泌包括果胶酶、甘露聚糖酶在内的非纤维素物质 降解酶 (张运雄， 2000；谭秀山， 2004；李保坤， 2005)。 露聚糖的分子结构 与降解 甘露聚糖 (泛存在于植物 材料中 ，是一类主链由 1， 4甘露糖苷组成的多聚物，主链和侧链可以被葡萄糖、半乳糖等取代 （吴襟， 1999；等） 。不同的生物其甘露聚糖含量存在很大差别。魔芋、豆科植物中的咖啡、长豆角、槐豆角种子、一些海藻等甘露聚糖的含量较高，含量为 45 ( ,1950; ,1953; ,1961)。不 同来源的甘露聚糖 其组成和结构也是不一样的。甘露聚糖基本可以分成两类，一类为半乳甘露聚糖 （ ，其主链为同质 1， 4甘露糖苷，侧链为 1， 6半乳糖苷，另一类为半乳葡萄甘露聚糖(主链由 1， 4甘露糖苷，少量 1， 4葡萄糖苷组成，侧链由 1， 6半乳糖苷组成 （图 。软木 （针叶木） 是主要的造纸原料，软木的半纤维素主要为乙酰半乳葡萄甘露聚糖（ ,主链由 1， 4甘露糖苷和少 量葡萄糖苷组成，侧链为 1， 6半乳糖苷；硬木 （阔叶木） 的半纤维素主要为木聚糖（ 少量为葡萄甘露聚糖（ (2；槐豆角的甘露聚糖基本为半乳甘露聚糖；魔芋的甘露聚糖基本为葡萄甘露聚糖 (995； ,1999)。不同甘露聚糖的结构残基组成是不一样的，例如槐豆角甘露聚糖的甘露糖与半乳糖组成比列为 4： 1，而 象牙棕榈果（ 的甘露聚糖结构残基 99为甘露糖 (999)。 1. 4) - 4) - 4) - 4) 典型的甘露聚糖分子结构 2. 4) - 4) - 4) - 4) 典型的葡甘露聚糖分子结构 3. 4) - 4) - 4) - 4) 6) 已酰基在 典型的半乳甘露聚糖分子结构 第一章 绪 论 3 4. 4) - 4) - 4) - 4) 6) 已酰基在 典型的半乳 葡苷 聚糖分子结构 图 甘露聚糖、葡苷聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡苷聚糖分子结构示意图 (002) 甘露聚糖既是重要的细胞壁结构物质，又是重要的营养源。甘露聚糖是一类结构比较稳定，普通方法难以降解的物质，比如苎麻原料中的甘露聚糖采用普通的高温、高压方法都难以降解，必须采用强碱、高温高压的极端方式才能去除，这不仅给环境造成了严重的污染，而且使麻类原料的加工成本大大提高 (张运雄， 2000)。甘露聚糖的生物降解效率 比较高。甘露聚糖的生物降解是依靠一系列酶来完成的。甘露聚糖的降解主要依靠内切甘露聚糖酶（ 1， 4 ,将甘露聚糖降解成甘露寡糖、二糖、三糖等，外切甘露聚糖酶也能发挥一定的作用，甘露聚糖的彻底降解还需要甘露糖苷酶 (葡萄糖苷酶 (.半乳糖苷酶 (乙酰甘露聚糖脂酶（ 。其作用方式是，内切甘露聚糖酶随机水解 1，4 糖苷键主链， 半乳糖苷酶水解末端 1， 6 D 半乳糖苷残基， 甘露糖苷酶从非还原端降解 1， 4 甘露糖残基，使其降解成甘露糖 （ ， 1997;张运雄 等 ， 2003） ，上述酶的协同作用将有力地促进甘露聚糖的迅速彻底降解。 露聚糖酶的应用前景十分广阔 近些年的研究表明，甘露聚糖酶的应用前景十分广泛，可以用于纺织、食品、饲料、造纸、石油开采等诸多领域 （ 襟， 2000） 。所以 ，研究和开发性能各异的甘露聚糖酶具有重要的意义。 苎麻半纤维素的主要成分为葡萄甘露聚糖，必须采用极端的措施 （强碱，高温高压） 才能脱除 (张运雄， 2000)，既增加了生产成本，又给环境造成了严重污染 。如果采用高产甘露聚糖酶的细菌进行脱胶，这一问题将迎韧而解。 甘露聚糖酶在食品工业中的应用主要使用于甘露寡糖的生产。杨文博 (杨文博 等 ， 1995)等报道用 甘露聚糖酶酶解植物胶，产物中含有由不同单糖分子（ 2 10 个单糖单位）组成的低聚糖。这些寡糖是一种新型的功能低聚糖，能改善动物体内消化道内微生物区系，对人体肠道内的 有益细菌 双歧杆菌有促进生长的作用 （秦湘红 等 ， 2003） 。甘露寡糖还能抑制病原菌、腐败菌的繁殖，有效地改善肠道菌群结构，使粪便以及尿液的理化性能得以改善。此外，它还能刺激动物机体的免疫功能，降低动物肌体的胆固醇和中性脂肪酸含量。 豆粕、棉粕、菜粕等是最常用的植物蛋白原料，其所含木聚糖、果胶、甘露聚糖等非淀粉多糖往往影响其利用率 。 甘露聚糖是粕类饲料中的抗营养因子 。 在饲料中加入相应的非淀粉多糖酶可以有效地提高饲料的利用率 （崔立 等 ， 1999；黄小文 等 ， 2003） 。 生物漂白是造纸工业发展的重要方向之一。很长一段 第一章 绪 论 4 木聚糖酶。但随后的研究表明，甘露聚糖酶也能在生物漂白中发挥重要的作用 (1998; ,1992,1993; ,1990;992;993;995;986,1991, 就现有造纸工艺而言，开发高效耐碱或嗜碱 、耐高温的 甘露聚糖酶对促进生物漂白工业化具有积极意义。 甘露聚糖酶可用于石油 、天然气 压裂破胶，能显著提高石油 、天然气 开采量，提高资源的利用率，提高经济效 益 （吴襟， 1999， 2000； 997）。 本研究的目的在于 研究 营养特性，其在草类纤维原料生物提取过程中的物质变化规律，并 从该菌株克隆甘露聚糖酶基因，实现高效表达，不仅能深入揭示该菌株的高效生物脱胶、生物制浆机理，从而为进一步改良该菌种提供理论依据，而且进一步明确了欧文氏杆菌（ 因组部分序列的功能，丰富了欧文氏杆菌基因组学研究内容，同时，可以开发该酶应用于食品、医药、纺织等行业，因而本研究具有重要的理论与实用价值。 内外甘露聚糖酶研究现状 甘露聚糖酶的研究可以追溯到上世纪初 （ 996）。 直到 1950 年代以后，许多产 甘露聚糖酶的微生物陆续被发现报道，其研究才逐步活跃和深入起来。微生物 甘露聚糖酶的早期研究主要集中在菌种的筛选、诱变，酶的提纯及性质等方面。近些年来，人们发现甘露聚糖酶具有广泛而光明的应用前景， 因而 对甘露聚糖酶的功能和应用领域拓展研究越来越重视了。 露聚糖酶的来源 甘露聚糖酶广泛存在于自然界中。在一些低等动物，如海洋软体动物 道分泌 液中，豆类植物如四棱豆、长豆角等以及西红柿、胡萝卜萌发的种子中，天南星科植物（ 芋萌发的球