【毕业学位论文】（Word原稿）除草微生物禾长蠕孢的菌种改良与制剂的研究农业微生物博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 除草微生物禾长蠕孢的菌种 改良与制剂的研究 on of on of I 摘 要 化学防治杂草给农业的发展做了较大的贡献，但伴随着环境污染、杂草抗性增加、农产品安全等问题。因此开发新型环保型除草剂、减少化学除草剂的使用是未来农业发展的趋势。发展微生物除草剂，实现杂草的生物防治，可以大幅度减少 化学除草剂的使用，实现农业的可持续发展。 禾长蠕孢菌稗草专化型（ f. 弯孢菌（ 中国水稻研究所杂草室从自然感病稗草上分离得到的两株病原真菌，它们是稗草的生防潜力菌株。 稗草致病力强，但孢子产量低，而孢子产量高，但对稗草的致病力弱。本研究根据这两个菌株的特性，采用原生质体融合技术，将两者优良特性结合起来，培育出孢子产量提高、代谢产毒能力强、适 合工业化发酵的优良工程菌株。并对探讨该菌株的发酵产毒素工艺、毒素微乳剂的制备技术，调查融合菌株的毒素田间防治杂草效果。获得以下主要结论： 1. 确定了禾长蠕孢和弯孢菌的原生质体释放最佳条件。 2% 溶壁酶 + 2% 蜗牛酶、 2% 纤维素酶 + 2%蜗牛酶分别为弯孢菌（ 禾长蠕孢菌（ 佳溶菌酶组合； 6 h、 24h。原生质体经过液体培养基再生后，获得了较高的再生频率， 原生质体再生率分别为 、 2. 获得 了较高的融合率。低浓度 氨酸溶液有利于弯孢菌与禾长蠕孢菌的原生质体融合，其融合率为 10 10过对融合子生物学性状的评价，筛选出四株产毒素提高的融合子，其中融合子 037 毒素 的合成能力较其亲本 高了 34；温室评价 间的融合子，获得了两株孢子产量和生防潜力提高的融合菌株 012、 053，其孢子产量较其亲本 对稗草鲜重防效和干重防效分别提高了 3. 纹分析融合子与亲本的亲缘关系，验证了融合子遗传物质偏亲现象和融合过程中发生了遗传重组。 4. 确定了融合子液体产毒素的摇瓶发酵条件为：菌株 037；培养基为马铃薯 200g，葡萄糖 30g，麸皮 20g,酵母膏 1g， g,g；菌丝体接种量 10。 5. 确定了融合子 037 粗毒素的 10微乳剂剂型配方： 10粗毒素 15助溶剂（ 8 9# +7% 5#） + 15% 乳化剂 （ 1# +9#） +2% 氮酮 58 水。该制 剂在大田条件下对丁香蓼、节节菜和水莎草的防治效果较好；结合低剂量化学除草剂（苄嘧磺隆 +二氯喹啉酸）复合使用，该制剂对稗草和鸭舌草的防治效果达到 80以上。 键词 禾 长 蠕 孢 菌 稗 草 专 化 型 （ f. 弯孢菌 （ 原生质体融合 微乳剂 稗草 (L.) he to of of of of to be to of of in of to of f. by of to to L to of th is to of by as as to of to to of to to in of as 1. as L % % 1 % % 6 h L 4 h 1. in a h L 1. 2. a 10- 3 1 L、 10- 4 3 L. 037, a 1. 3 L, a in of 012 053 ， 3. on of IV 4. 037 as 00 g/L, 0 g/L, 0 g/L, g/L, g/L, g/L as 0 as 5. 0% 0% 8% # + 7% # +# + #+ 2% 58% a as of , it 0%, 5%. f. L.) V 目 录 第一章 文献综述 . 1 生物除草剂 . 1 体微生物防治杂草的潜力及研究进展 . . . 微生物天然产物防治杂草的潜力及研究进展 . .响微生物除草剂商品化的因素 . .草微生物分离与筛选 . .草微生物的菌种改良 . . 微生物除草剂剂型研究 . .题的意义与目的 . . .研究内容和技术路线 . 13 究内容 . 13 技术路线 . 14 第二章 原生质体的融合及融合子的鉴定与评价 . 15 料与方法 . 15 料 . 15 验方法 . 17 据分析 . 20 果分析 . 20 合亲本的基本性状 . 21 生质体融合 . 24 合 子的 纹分析 . 31 合子对作物的安全性评价 . 35 论 . 35 第三章 融合子的液体发酵研究 . 38 料与方法 . 38 验材料 . 38 验方法 . 38 验结果 . 44 丝生长培养基的筛选 . 44 体摇瓶发酵条件的优化 . 45 0L 发酵罐放大 试验 . 47 酵液中毒素酸碱稳定性试验 . 49 论 . 50 第四章 禾长蠕孢粗毒素微乳剂剂型的制备及田间应用评价 . 52 料与方法 . 52 验材料 . . 试验方法 . .据分 析 . .验结果 . 54 0粗毒素微乳剂的制备 . . . . . 毒素作用方式试验 . .间除草药效试验 . .讨论 . 64 第五章 全文结论 . 66 参考文献 . 67 致谢 . 76 作者简历 . 77 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 植物根际有 害细菌 高效液相色谱 乳剂 铃薯葡萄糖琼脂培养基 铃薯葡萄糖液体培养基 随机扩增多态性 国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 目前 ,对稻田杂草的防治主要依赖化学除草剂。但化学除草剂的长期使用 ,其残留对作物的药害时有发生 ,局部地区农田和水环境被污染 ,杂草抗药性生物型增多 ,给农业可持续发展构成潜在威胁（李迪等， 2004）。而生物源除草剂以其资源丰富、毒性小、不破坏生态环境、残留少、选择性强、对非靶标生物和哺乳动物安全、环境兼容性好等优点，正逐步引起人们的重视（ 付颖和叶非， 2002） 。 生物除草剂 微生物除草剂是指将本地流行的能快速繁殖的杂草病原菌活体或其具杀 (抑 )草毒性的 代谢产物（植物毒素），制成一定的剂型，在杂草易感病期间施用的杂草生防制剂。利用微生物防治杂草或者把它作为一种辅助手段用于杂草防治。通常包括利用活体微生物和利用微生物天然产物 2种方法 。 活体微生物防治杂草的潜力和研究进展 近 40 年来，利用活体微生物，主要是植物病原微生物（真菌、细菌、病毒）防治杂草有较多的报道。最常见的植物病原物是真菌，它可以直接穿透寄主表皮，进入寄主组织，代谢产生毒素，抑制杂草的生长。真菌也比病毒和细菌易于人工大量繁殖，制成孢子除草剂。病毒和细菌一般只能通过植物的伤口、或通过昆 虫的媒介作用感染侵入，但自然侵入很难。利用活体微生物防治杂草分传统的微生物防治法和应用微生物除草剂 2 种主要途径，前者是从杂草的原产地引入寄生性和传播能力均较强的病菌，在田间接种释放引起目标杂草的病害流行，从而把杂草数量降低到危害阀值以下，通过天敌保持着一种动态平衡。该方法适用于防治水域、牧场等人为干扰较少的生境。成功应用这一途径的著名事例是澳大利亚从欧洲引入锈菌（ 防治麦田粉苞灯苣（ .） 。 1971 年澳大利亚为了控制东南部杂草粉苞 灯苣而引进此菌，这种杂草严重危害了上百万英亩的小麦和牧草。从意大利的维埃斯特（ 采集的这一菌株是澳大利亚粉孢苣的高毒力拮抗株，而且显示了对粉孢苣的专一性（ 972;1973）。 1975 年，从意大利的埃博利 (集的两株粉苞苣柄锈菌被引种到美国。两年内在加利福尼亚和俄勒冈州，这种真菌迅速传播引起优势杂草群体的严重感染，同时在太平洋西北沿岸的另两个州爱达华州和华盛顿州现在也可见到这种真菌的存在。另外对粉苞苣的形态学及其对锈病菌株的易感性也进行了描述。 为接种物是用飞机按每公顷接种量 2 克孢子粉进行撒播，在短期内引起锈菌感染，被粉苞苣柄锈菌感染的粉苞苣显著降低了植株生物量、花和种子的数量。该菌严重感染莲座 (，能够使植株在开花前死亡，而且当地气侯条件有利于该菌的侵染 ,使该杂草的死亡率达到 90 (， 1981; 986)。 1975 年藿香蓟小尾孢 (从牙买加引种到夏威夷控制菊科的种植物是夏威夷的森林和牧场中最严重的杂草（陈勇强等， 1998;顾成波和赵长中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 山， 2003）。 对该真菌的寄主范围进行了 29 科 40 种代表植物的试验，证实此真菌专性寄生于株。 从 1975 年 到 1976 年 5 月进行实验，在这一地区的有利气侯条件下，病原菌感染率很高，杂草群体在九个月内从 80 降到 5。病害发生在夏威夷全区，但控制最好的地区是在海拔 范围内。 1988 年 新对该菌株进行了鉴定，确定为菊叶黑粉菌 (一有性世代的 名称。 微生物除草剂，是将杂草的致病菌进行大量培养，制成标准化的制剂，象化学除草剂一样，当杂草处于敏感生长阶段时，于苗前或者苗后施用，使杂草病害流行，从而实现控制杂草的目的。该方法在短时间内可有效地控制草害，适用于防治农田、草坪、及公园中的杂草。近年来，微生物除草剂尤其是真菌除草剂的开发和研究获得了突破性进展，已约有 80 种不同的侵染生物菌种被研究，防除约 70 种杂草。按照发展生物除草剂的标准，有望作为候选或已发展成生物除草剂的有 36 种，已经使用或商品化或极具潜力的有 19 种（顾成波和赵长山， 2003）。真菌类有潜力的微生物主要集中在 9 个属：盘孢菌属 (镰孢菌属 (链格孢菌属（ 尾孢菌属 (疫霉属 (柄锈菌属 (叶黑粉菌属(壳单孢菌属 (核盘菌属 (虽然首选的是那些可以引起致命性病害如炭疽病、萎焉病、枯萎病及叶斑病的种群，但其选择范围仍是相当广泛的。细菌类主要是根际细菌，主要有 7 个属：假单孢菌属 (肠杆菌属 (黄杆菌属(柠檬酸细菌属 (无色杆菌属 (产盐杆菌属 (黄单孢杆菌属 (陈勇强等， 1998）。表 1出部分已研究具有开发潜力的微生物除草剂菌株（付颖和叶非， 2002）。 其中，用于稻田稗草防治的主要菌株有内脐蠕孢菌（ 突脐蠕孢菌（ ( ， 1990; ， 1997)、链格孢菌（ ， 1995) 、 平 脐 孢 属 （ （ ， 2000 ） 、 弯 孢 属（ 1990）、镰刀菌属（ 梨孢属（ 长蠕孢属（ 985）、旋孢腔菌属（ 987）。 微生物除草剂成功商品化的例子，有 1981 年在美国被登记注册的 它是棕榈疫霉()制剂，用于柑橘园进行土壤处理防治莫伦藤 () （ 985; 1986）。 1972 年，从佛罗里达州里的感病死亡的莫伦藤植株上首次分离得到该菌。将它用于田间试验中，处理后 10周，对莫伦藤防效达 96。在 1978 年和 1980 年使用过 桔园， 6 年后仍保持 95100的防效（ 1985）。 随后， 登记（ 986; 986），它是美国阿肯色大学和 司开发的一种合萌盘长孢状刺盘孢合萌专化型 (f ，用于防除水稻及大豆田中的弗吉尼亚合萌。它的应用、贮藏和施用方式与一般苗后茎叶处理除草剂类似。 以引起幼苗的炭疽病，感染其茎、叶柄和小叶（ 1979）。在小规模的田间试验中，用 理后几周内， 被接种的弗吉尼亚合萌幼苗 100被杀死。商品制剂大田常规使用防效在 90以上 (1973)，在 1982 1991 年的 10 年内，每年美国稻田使用面积为 5 千到 1 万公顷 (万方浩和王韧， 1991)。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 表 1 1 具有开发成微生物除草剂的潜力菌种 名称 防除对象 球炭疽菌 （ C 茼麻（ A. 平头炭疽菌 C 大果田菁 （ S. 瓜类炭疽菌、圆盘孢 (C. 刺苍耳 (.) 柑橘褐腐疫毒 (莫伦藤 ( ) 交链孢属真菌 （ 决明 （ .） 核盘菌 （ 加拿大蓟 （ L.) 百日草链格孢 (A 苍耳 (粗链格孢 (曼陀罗 (柿子孢 (柿属杂草 () 飞机草尾孢 (和链格孢菌 (具腺泽兰 ( 刺盘孢属炭疽病菌 （ f 毛单室药草 (突脐蠕孢菌 （ 稗草 （ L.) 链孢霉 （ 穗状狐尾藻 ( 高粱点霉 （ 千屈菜 （ 平脐蠕孢属 菌 （ 扁叶臂形草 （ 砖红镰刀菌 （ 苘麻 （ A. 尖镰孢 (f 合欢 (腐皮镰孢霉 （ F. 南瓜属杂 草 (尖镰孢菌 （ F. f 大麻 (圆盘孢 （ 苍耳 ( 旋孢腔菌 （ 1 2 叶期稗草 （ L.) 拉宾黑粉菌 (马唐 (炭 疽 病 菌 （ 大麻 （ 炭疽 病 菌 （ f 卷茎蓼 （ .) 柄锈菌 （ 莎草 （ .） 链格孢 （ A. 、 尾孢菌 （ 、 尾孢菌（ C. 凤眼蓝 (炭疽菌 （ C. 圆叶牵牛 (叉梗孢 （ 马齿苋 (平脐蠕孢 （ 牛筋草 (壳针孢 （ f 野燕麦 (中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 由加拿大农业调查研究所开发、 司于 1992 年商品化的一种长孢状剌盘孢锦葵专化型 (f 简写为 粉剂，用于防治圆叶锦葵、苘麻（ 1992）。该菌是 1982 年从锦葵属杂草圆叶锦葵 (.)茎的炭疽病斑上分离得到的（ 1992）。其在可控环境条件下以 2 106 孢子 /30 以下、结露 20 小时以上的条件下喷洒接种于目标杂草，显示了很好的效果，处理后 1720 天杂草全部枯死。在田间试验条件下，用 6 107 孢子 /用后 48 小时内降雨或结露 12 15小时，保持 20左右的冷凉天气且在阴天的条件下防除杂草获得成功。 我国也是世界上较早研究和利用微生物防治杂草的国家之一， 1963 年山东农业科学院刘志海等（ 1980）研制成功一种对大豆菟丝子有特殊防效的微生物菌剂“鲁保一号”。“鲁保一号”是利用菟丝子盘长孢状剌盘孢 (又称胶孢炭疽菌菟丝子专化型 )(C )的培养物防除大豆田菟丝子。 60 年代中、后期，在江苏、山东、安徽、陕西、宁夏等 20 个省区推广面积达 60 万公顷，防治效果稳定在 85 以上（高昭远和干静娥， 1992）。 目前，世界上很多科研机构在研究微生物除草剂，并且已经分离得到许多有活性潜力的生防菌株，如日本自 1987 年以来已从稻田稗草上分离到 10,000 个病原菌（ 992; ，1992; ， 1997; ， 1998; ， 1998; ， 2001）。但由于活体微生物发病机制复杂，对环境有较高的依耐性。因此，成功商品化的活体微 生物除草剂却很少。表 2举了已商品化的微生物除草剂（付颖和叶非， 2002）。 表 2商品化的活体微生物除草剂 he in 名称 防除对象 棕榈疫霉 (致病菌株的厚垣孢子 (莫伦藤 ( 合萌盘长孢状剌盘孢（ f (弗吉尼亚合萌（ 纵沟柄锈菌 (油莎草（ .） 决明链格孢 (决明（ 望江南（ 美丽猪屎豆（ 锦葵盘长孢状剌盘孢（ f (防除圆叶锦葵（ ）、茼麻（ A. 银叶菌 (野黑樱 （ 等木本杂草 镰刀菌 (丝体 (制剂 ) 列当（ 盘长孢状剌盘孢（ C 大豆菟丝子 （ 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 5 黄单孢杆菌（ 高尔夫球场草坪杂草早熟禾（ 剂（ 瓜列当（ 砖红镰孢 1200 （ 豆科（ 草 炭疽菌 （ f 卷茎蓼（ .） 纵沟柄锈菌 （ 莎草（ .） 茎点 霉 菌 （ 炭疽病菌（ 田旋花（ .） 单胞锈菌 （ 皱叶酸模（ .）、田蓟（ L.) 、矢车菊（ 链格孢 （ 茼麻（ A. 链格孢 （ ） 南芥（ .） 长孢状剌盘孢（ f 锦葵（ M. .） 锈菌（ 灯心草粉苞苣 (微生物天然产物防治杂草的潜力和研究进展 近年来，以微生物天然产物开发生物源除草剂或新颖除草剂的先导化合物引起了杂草科学家和农药化学家的极大兴趣。利用微生物天然产物防治杂草具有许多潜在的优势：（ 1）杂草对现有除草剂抗性的发展需要发现作用方式新颖的除草剂。许多微生物天然产物具有不同于合成农药的化学特性，研究这些天然产物可能发现新的除草活性化合物，而其作用位点是现有除草剂未涉及到的； (2)这些微生物天然产物可作为先导化合物； (3)在低浓度时微生物天然产物比化学合成衍生而得 的化合物具有生物活性的可能性大； (4)已登记的化学除草剂，含有氯代烃类化合物的约占 60 ，大多数微生物天然产物几乎不含这些化合物，在环境中的半衰期比合成农药短得多，容易迅速降解或解毒，因此其为登记的试验比化学农药所用的时间短、资金少； (5)发酵技术、分子遗传学和基因工程最新发展，使大规模生产微生物天然产物防除杂草成为现实。 许多微生物 (植物病原菌 )在其专一性寄主植物上产生植物