【毕业学位论文】（Word原稿）甘蓝型油菜遗传连锁图谱的构建及油脂含量等品质性状的QTL定位作物遗传育种硕士论文

密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 甘蓝型油菜遗传连锁图谱的构建及油脂含量等品质性状的 位 TL I TL 要 油菜是植物油脂的第三大来源 , 已成为我国继四大粮食作物 (水稻、小麦、玉米、大豆 )之后的第五大农作物。低芥酸菜籽油不仅是良好的营养保健油 ，也是生物柴油的理想原料。发展油菜生产，提高油菜的生产效益，对提高人民的健康水平和解决制约我国经济发展的能源短缺问题具有极其重要的意义。 提高油菜品种油脂含量是提高油菜生产效益的重要途径。最近这五年，我国油菜高油脂含量品种虽呈上升趋势，但低油脂含量品种仍然占有较大份额，高油份育种已成为油菜育种的主要目标。同时，双低油菜籽蛋白具有合理的氨基酸组成，是良好的蛋白质源，适用于所有家畜饲料；硫甙含量的高低是衡量油菜品质性状的重要标准，高硫甙含量具有毒害作用；油酸属单不饱和脂肪酸，有利人体心血管健康，高油酸油易甲酯化 ，是生物柴油的理想原料。 因此，进行油菜油脂、蛋白质、硫甙和油酸含量等品质性状的研究对油菜育种具有重要指导意义。 本试验以高含油量杂交油菜中油杂 8号的保持系和恢复系配制正反交组合的 油脂、蛋白质、硫甙和油酸含量 4个品质性状进行了分析，并利用正交组合中 118份 建甘蓝型油菜的遗传连锁图谱，对油脂含量等品质性状进行了定位，结果如下： 1 在正交群体中， 蛋白质含量的分布介于 间，变化较小；油脂含量的分布范围较大，介于 间，群体中 个体超过均值；硫甙含量的变幅较大，极差达到 g；个体硫甙含量多分布于 酸含量的分布区间也较大，有 90个单株大于均值，占总数的 2 在反交群体中，各单株油脂含量多集中在 间，均值为 蛋白质 量的分布介于 间；硫甙含量的变幅较大，最小值为 g， 3 在正交组合 2群体中，油脂含量和蛋白含 量的相关分析都表明两者 之间存在极显著的负相关关系，即随着蛋白质含量的增加，油脂含量明显减少。反交组合 白质含量和硫甙含量的相关系数 r 极显著水平；蛋白质含量和油酸含量之间也存在显著的负相关关系，相关系数 r 甙含量和油酸含量存在正相关关系，相关系数 r极显著水平。 4 利用 18个单株，构建包含 121个标记的遗传连锁图谱，图谱总长 含 21个连锁群。标记间平均距离为 连锁群长度变动在 11.0 165.5 间，群内平均图距在 间 。 为 11个； 个 。 5 采用单标记法检测到油脂含量的 3个 别位于 个）；用 脂含量的 4个位点，分别位于 献率在 个 油脂含量的 分别位于 献率为 6 用 单标记法确定了 8个蛋白含量 中 5个位于 2个位于 有 1个分布于 用 个蛋白含量位点，一个位于 献率为 存在正加性效应；另一个位于 型贡献为 加性效应为负。 7 单标记法检测到位于 个硫甙含量的 个硫甙含量的献率分别为 加性效应都为正值； 个硫甙含量的 别位于 个 贡献率在 间， 3个位点表现出正加性效应， 1个位点表现负加性效应。 关键词：甘蓝型油菜，油脂含量，蛋白含量，硫甙含量，油酸含量， he is of is of To is of of of is in of in in an of of a of of a of of is in is to to is to be so it is an of on as is of in 2 908B18 F2 a is TL of as 1. 2 of IV in of g, g g. 2. 2 of of , an of is of is a g, g. of 3. In of of 2 of of of of is 4. 18 F2 a . up 1 21 in an As 1.0 cM 65.5 . of G4 1, 5. TL of A of in G 20 to by of G8 OD .2 by 6. by of G3 TL of G1 of G3 of TL by 7. TL by of V ., 略 词 表 缩 写 词 文 全 称 文 名 称 P IM H M E he og of he ,N,N,N硫酸铵 混合分组分析法 复合区间作图法 厘摩尔根 溴化十六烷基三甲基氨 双单倍体 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 区间作图法 多点区间作图法 混合线性模型 似然比 标记辅助选择 开放可读框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 数量性状位点 重组自交系 零区间作图法 三羟甲基氨基乙烷 三羟甲基氨基乙烷 乙二胺四乙酸 三羟甲基氨基乙烷 乙二胺四乙酸 三羟甲基氨基乙烷 四甲基乙二胺 目 录 第一章 文献综述 . 1 物遗传连锁图谱的研究 . 1 谱构建的理论基础 . 1 图群体 . 1 用的分子标记 . 3 谱的构建 . 8 量性状基因 （ 定位 . 8 位的原理 . 8 位的方法 . 9 图谱构建及 析有关的计算机软件 . 11 薹属作物遗传图谱研究进展 . 12 菜油脂研究 . 15 脂含量的遗传基础 . 15 脂生物合成代谢途径及调控 . 15 脂含量的 位 . 17 脂含量与品质性状的遗传相关 . 18 研究的目的和意义 . 20 第二章 甘蓝型油菜蛋白质、油脂、硫甙及油酸含量的性状分析 . 21 料与方法 . 21 验材料 . 21 验方法 . 21 果与分析 . 22 交组合 体中蛋白、油脂、硫甙和油酸含量的性状分析 . 22 交组合 体中蛋白质、油脂、硫甙和油酸含量的性状分析 . 25 反交组合 体中蛋白质、油脂、硫甙和油酸含量的性状比较 . 28 论 . 30 第三章 甘蓝型油菜油脂、蛋白质、硫甙和油酸的 . 32 验材料 . 32 验方法 . 32 状考察 . 32 因组 提取及质量检测 . 32 析 . 33 析 . 34 电泳及染色 . 35 据处理 . 36 果与分析 . 36 图亲本纯度分析 . 36 物筛选及多态性分析 . 37 物筛选及多态性分析 . 37 遗传连锁图谱的构建 . 38 白质、油脂、硫甙和油酸的 测 . 40 论 . 45 图群体 . 46 子标记的选择 . 46 析方法与 分布 . 46 的影响 . 47 境效应与上位性效应 . 47 状间的相关性 . 47 传连锁图谱的长度 . 48 参考文献 . 50 致 谢 . 60 作者简历 . 61 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 物遗传连锁图谱的研究 作物遗传连锁图谱是基因组图谱的一种 。 它反映了少数功能基因与遗传标记之间的相对关系 , 是进行重要性状基因位点分析的基础。经典的遗传图谱是以形态、同工酶等生理生化常规标记来构建的 , 而现在的分子遗传连锁图谱则基本上是以 海英等，2003）。 目前，遗传连锁图谱逐渐趋向高饱和化、实用化和通用化的方向发展。高饱和化，也就是增加图谱上标记的密度，高密度的遗传图谱有助于基因定位、基于图谱的基因克隆和精确分析数量性状基因；实用化即遗传 连锁图谱可以直接应用到植物育种中 , 利用遗传连锁图谱导入野生种的有利等位基因；通用化即遗传连锁图谱的信息可以在种内甚至种间交流 , 而不局限于作图亲本（张海英等， 2003） 。 谱构建的理论基础 染色体的交换与重组是 遗传 连锁图谱构建的理论基础 （方宣钧 等 ， 2001） ，即同源染色体减数分裂过程中发生交换，使染色体上的基因发生重组。在两个基因之间发生重组的频率则取决于它们之间的相对距离，因此只要准确地估算出交换值，进而确定基因在染色体上的相对位置 , 就可构建出连锁遗传图（王永飞等 , 2001）。简而言 之， 遗传图谱的构建就是以交换频率来推算 同源染色体上标记 间的 交换与 重组并 将其 转化为遗传距离，进而把相应的标记顺序排列在一个连锁群上的过程 。 图群体 图群体的大小 作图群体的大小很大程度上决定了遗传图谱的分辩率和精确度。理论上，作图群体越大，等位基因分离的越彻底，检测到 可能性也就越大，但费时费力（席章营等， 2005）。何小红等（ 2001）研究了样本容量对 现能力的影响，发现 现能力与样本容量的变化呈非线性的关系，样本容量增大， 现的能力逐渐增强后，趋于平 缓。所以，在群体大小的选择上 应当根据实际情况和目标 ， 权衡 后 确定合适的群体大小。方 宣钧等（ 2001）认为构建分子标记骨架连锁图，可基于大群体中的一个随机小群体如 150个单株或家系，当要在特定基因组区域精细作图或定位微效 ，再有针对性地在骨架连锁图基础上扩大群体。 这种方法既可达到研究的目的，又 有效的 减轻 了 工作量 。 图群体种类 用于构建遗传连锁图谱的群体有很多种，不同的作图群体其特点也不相同，见表 1 1（席章营等， 2005）。根据分离群体的特点，可分为临时群体、永久性群体和近等基因系群体三 大类。 临时群体包括单交组合产生的 其衍生的 系以及回交群体，它的显著特征是群中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 体中的每一个个体其后代均可发生分离（刑永忠， 2001）。由于临时性群体容易获得 ,早期 体 ：早期最常用的作图群体 。这 类 群体易于配制，且不需很长时间。 体提供的遗传分析信息最为丰富，利用共显性标记，可区分按孟德尔分离规律分离的三种基因型（ 1： 2： 1），同时估计加性效应和显性效应。 体的一个不足之处是存在杂合基因型。对于显性标记，将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型，这种基因型信 息的简并，会降低作图的精度。 另一个缺陷是 株存在分离，很难进行多年多点研究， 不易长期保存，有性繁殖一代后，群体的遗传结构即发生变化 （张帆等， 2004） 。 体 ： 分离基因座 的 两种基因型，直接反映了 配子的分离比例，可区分雌、雄配子在基因间的重组率上是否存在差异 ， 因而 该 群体的作图效率 较 高 。但与 体相比，同源染色体间重组交换的几率减少一半，仅为 1/2，因此其包含的遗传信息量较 体少 1/2。而且它不 易 保存 ， 不适合于人工杂交比较困难的植物。 永久性分离群体主要包括重组自交系群体 ( 和双单倍体群体(,其显著特征是群体间存在基因型差异，群体内每一个体其后代稳定 ,不发生分离，可以连续不断地提供家系内遗传上一致的种子。因此，该类群体可以在不同时间，不同地点进行重复区组试验，还可把区组效应、重复效应和随机误差最小化或分解开来，增加检测 准确性。 体 ： 体是一种可以长期使用的永久性分离群体 ， 群体中每一个株系都是纯合的，特别适合于 定位研究 。它 是杂种后代经过 多代自交而产生的一种作图群体，通常从 通过 单粒传 代 （ 方法建立。但是，构建 体需要花费 的时间 较长 。建立一个无限大的 体，必须自交无穷多代才能达到完全纯合，据推算，对一个拥有 10 条染色体的物种，要建立完全纯合的 图群体 ， 至少需要自交 15 代。在实际研究中，人们往往无法花费这么多时间来建立一个真正的 体，所以常常使用自交 6 7 代的 “ 准 ”体 （ 吴为人 等， 1997） 。从理论上推算，自交 6 代后，单个基因座的杂合率只有大约 3%，基本接 近纯合。实践证明利用这样的 “ 准 ” 体来构建分子标记连锁图谱仍是可行的 （ 李维明 等 , 2000） 。 但该群体存在一个明显的不足即不能估测显性效应。 体 ：培养 体最常用方法是通过花药培养。 株是纯合的，自交后即产生纯系，因此 体也属于一种永久性群体，其遗传结构直接反映了 子中基因的分离和重组，因而具有与 席章营等， 2005）。 体可以 长期 使用，因此适 用 于 目前， 花 药 培 养 技术是制约 体建立的一个关键因素。另外 ， 花培过程 也 会对不同基因型的花粉产 生选择效应，破坏 体的遗传结构，造成较严重的偏分离现象，从而影响遗传作图的准确性。 临时性分离群体和永久性分离群体在 即对 效应小的 测能力有限，增加群体大小和分子标记数目也只能在一定程度上缓解这种局限性。 近等基因系 (基本特征是整个染色体组的绝大部分区域完全相同，只在少数几个甚至一个区段彼此存在差异，因此，它能使基因组中只存在一个或几个 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 消除其他背景干扰，消去主效 管近等基因系构建时间长，工作量大，但近等基因系对 永忠， 2001）。 表 1 1 主要作图群体类型及特点 1 of 2 H 成 交后代 交后代 培 交多代 交多代 确 度 低 低 中 中 高 需群体大小 大 大 小 小 小 of 否永久群体 否 否 是 是 是 建 时 间 短 短 长 长 长 建 费 用 少 少 中 中 高 离比率 1:2:1 1:1 1:1 1:2 1:1 of 常用 的分子标记 子标记是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的差异来反映基因组之间的差异的一种有效手段。 其来源有单碱基和多碱基突变 ，具体 包括 由 碱基替换、插入、缺失 、 段重排、倒位和序列重复 等因素 引起的变异。这些 段可将基因组 过限制性内切酶酶 切 、 分子杂交 以及 或杂交膜上 ） 检测到。 它 是在分子生物学基础上发展起来的新一代遗传标记，与其他的遗传标记（形态标记、细胞标记、生化标记）相比，具有以下优点： 1）不受 环境 的影响，可以对 不同发育阶段的 个体、组织、器官乃至细胞 进行 检 测 ，不存在 基因是否表达的 问题 ； 2）数量非常丰富， 遍及整个基因组； 3）有些标记是共显性标记，可 鉴别纯合基因型和杂合基因型 ， 提供完整的遗传信息； 4）遗传稳定， 对生物体影响表现为“ 中性 ” ， 不影响目标性状的表现，和不良性状 也 无必然连锁 ， 这些优点使分子标记 技术 在物种起源与进化、生物多样性、遗传图谱构建、基因定位 以及 分子标记辅助选择等方面广泛应用 （何风华，2004;赵淑清等， 2000；辛业芸， 2003）。 分子标记技术大概可以分为三大类。第一类是以 交为基础的分子标记， 其代表性技术有 术 。 它是利用内切酶及电泳技术分离不同生物体的 子，再用经过标记的特异 针与之杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术表现其多态性。 前者主要是以低拷贝序列为探针进行分子杂交 ，其多态性来源于内切酶的酶切位点和位点间 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 出现的突变 ， 这类标记多与编码基因相关，以共显性的方式遗传，在遗传连锁图谱和指纹图谱的构建等方面具有重要的价值。 后者 即数目可变串连重复多态性。其多态性是由同一座位上的串连单元数量的不同而产生。该技术虽一次可检测到几十个基因座位数，但操作繁琐，成本较高。 第二类是以 基础的标记，这是随 术诞生而发展的第二代分子标记技术。自 术建立以来，许多新的分子标记技术相继出现，如简单序列重复 （ 、扩增片断长度多态性 （ 、序列标签位点（ 序列特异扩增区域（ 等。第三类，则是基于 片的分子标记技术。该技术 利用核酸杂交来检测未知的分子，是以 列分析为核心的分子标记技术 ，目前应用于 代表性的技术单核苷酸多态性（ ,被称为第三代多态性标记。下面重点介绍几种常用的分子标记技术。 1) 限制性