【毕业学位论文】（Word原稿）日粮添加豆油和胡麻油对奶牛瘤胃细菌及发酵参数的影响动物营养与饲料科学博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 博士学位论文 日粮添加豆油和胡麻油对奶牛瘤胃 细菌 及 发酵参数 的影响 il il I 摘 要 本研究 通过 对奶 牛常用 20种精粗饲料常规营养成分及脂肪酸 组成 的测定 ， 以亚油酸和亚麻酸的含量为基础， 研究 奶牛 日粮（ 精粗比为 40:60） 不添加油脂（ 添加 4%豆油（ 4%胡麻油（ 及 2%豆油加 2%胡麻油（ 瘤胃发酵 参数和 微生物酶活性 的影响， 同时运用传统的培养方法和荧光实时定量 讨 不同比例植物油来源亚油酸（豆油）和亚麻酸（胡麻油） 影响瘤胃发酵的微生物（细菌）机制。 试验 结果 表明，（ 1） 奶牛常用 20 种精粗饲料脂肪酸都由饱和脂肪酸（ 不饱和脂肪酸（ 成，且都以 肪酸为主；但不同的脂肪源其脂肪酸组成特点不同 ， 饲料中 含量大都在 10%以下，能量和蛋白饲料中富含 （ 油酸 ） 和 （ 亚油酸 ） ，而 （ 亚麻酸 ） 在饲草脂质中含量较高。 （ 2） 与 相比， 添加油脂对瘤胃内 、瘤胃乙酸和丙酸浓度没有显著影响（ P但显著降低了戊酸、丁酸 、 总挥发性酸浓度（ P 、 瘤胃纤维素酶活性（ ； P 脂肪酶活性（ ； P 以及显著增加了瘤胃度（ mg/P 对瘤胃各发酵参数以及微生物酶活性的 影响 无显著差异（ P 。 （ 3）与 相比， 添加 油脂 对总活细菌和淀粉分解菌数量无显著影响（ P ，但 显著降低了纤维分解菌（ 08 08； P 和 原虫数（ 05 05； P以及 显著增加 了 瘤胃蛋白分解菌 （ 08 08； P ； 除 显著降低了瘤胃淀粉分解菌数量外， 它 与 对瘤胃 其它 细菌和原虫数 量 的影响 差异 不 显著。 对纤维分解菌和原虫有更强烈的抑制作用。 瘤胃细菌中各菌群数及原虫数量在不同时间点上呈现一定的变化规律。 （ 4） 改进并 完善了瘤胃微生物总 取方法和 瘤胃微生物 荧光实时定量 术，并运用 此技术研究了奶牛日粮（ 精粗比为 40:60）中添加 4%的豆油和胡麻油对脂肪 降解 菌（ 、 氢 化 菌 （ 以 及 纤 维 菌 （ 数量 的影响。 研究 表明，与 相比， 添加植物油后的 数量显著降低 （ P ， 平均值 分别降低了 18%， 42%和 67%； 量 与 相比 差异不显著 （ P ； 胡麻油 （ ） 抑制作用 显著 大于豆油 （ ） 的抑制作用 （ P ，而二者的混合油 （ ） 有效 改善了对 抑制 效应 。 本研究表明：（ 1） 饲料中高级脂肪酸主要有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸 ， 且不同来源的饲料其营养特性和脂肪酸组成和含量不一样。 （ 2） 奶牛日粮中添加 4%的 豆油和胡麻油 对瘤胃 发酵 参数 、 微生物酶 活性 、瘤胃纤维分解菌和原虫数 存在 负效应 ； 而 对 瘤胃总活细菌和淀粉分解菌数无显著影响。 （ 3） 奶牛日粮中添加 4%的 豆油和胡麻油 显著降低了 量 ， 胡麻油对 氢化菌和纤维菌的抑制作用 大于豆油， 二者 组合（ 混合油 组 ） 能 有效 改善 对细菌的抑制效应。 （ 4） 豆油 和 胡麻油 对瘤胃发酵参数 、微生物酶活性 和微生物 群落 的抑制作用无显著差异 ，但 胡麻油 的抑制作用更强 。 （ 5） 豆油 和 胡麻油对瘤胃发酵参数和 微生物的抑制作用主要是通过 亚油酸 和 亚麻酸 发挥 作用 的， 且这种 抑制作用有效地解释了瘤胃发酵参数变化的原因。 关键词： 豆油 ， 胡麻油 ， 瘤胃发酵 ， 微生物 ， 奶牛 I on 0 by of to of of by of NA by CR of 52138510d) in a 4 x 4 2in a 0% 0% 4% 4% % % of In , of 16 18 in of in 0%, 18:118:2, 18:3 of in In , pH of to K. of mg/p No of in In , of NA of by CR At of % of on . by NA p . in to of (1) in in (2) 4% of M) to (3) % NA In at of to in . (4) of by (5) of on on I 目 录 第一章 绪论 . 1 究目的和意义 . 1 内外研究进展 . 2 粮添加脂肪对瘤胃内环境的影响 . 2 粮组成对 瘤胃微生物区系 的影响 . 4 胃中参与脂 肪降解与氢化的微生物 . 5 胃微生物培养和分子生物学研究技术 . 7 在的问题与对策 . 12 究内容和技术路线 . 13 究内容 . 13 术路线 . 13 第二章 奶牛常用饲料营养特性及脂肪酸组成特点的研究 .要 . 14 的意义 . 14 料与方法 . 14 品采集、制备及检测指标 . 14 定方法 . 14 据分析 . 15 果与分析 . 15 料常规成分及营养价值 . 15 料脂肪酸组成特点 . 16 论 . 21 料脂肪酸组成特点 . 21 料脂肪酸与牛乳脂肪酸组成间的关系 . 21 第三章 日粮添加豆油和胡麻油对奶牛瘤胃发酵及微生物酶活性的影响. 要 . 23 的意义 . 23 料与方法 . 23 验动物、日粮及饲养管理 . 23 品的采集 . 25 析方法 . 25 果与分析 . 26 同日粮对奶 牛瘤胃发酵参数的影响 . 26 同日粮对瘤胃微生物酶活性的影响 . 28 论 . 30 结 . 31 第四章 日粮添加豆油和胡麻油对奶牛瘤胃微生物区系的影响 . 要 . 32 的意义 . 32 料与方法 . 32 验动物、日粮及饲养管理 . 32 品的采集 . 32 生物计数 . 33 计分析 . 35 果与分析 . 35 同日粮处理对瘤胃微生物数量的影响 . 35 同时间点对瘤胃微生物数量的影响 . 36 论 . 37 结 . 38 第五章 日粮添加豆油和胡麻油对瘤胃脂肪降解与氢化菌及纤维菌的影响 . 要 . 39 的意义 . 39 料与方法 . 39 材料 . 39 法 . 40 果与分析 . 43 取奶牛瘤胃微生物总 泳图 . 43 菌普通 泳图 . 44 白斑筛选及阳性克隆 定 . 45 性克隆的 测序与比对 . 46 品中五种细菌定量结果 . 46 论 . 49 关瘤胃微生物 量方法的探讨 . 49 同日粮处理对瘤胃微生物数量的影响 . 50 结 . 52 第六章 总体讨论与结论 .文总体讨论 . 53 文总体结论 . 54 研究创新点 . 54 待进一步研究的问题 . 54 附录：瘤胃微生物学研究技术 .考文献 . 谢 . 者 简 历 . 目 录 表 1胃细菌菌株及其氢化亚麻酸、亚油酸和油酸的能力 . 5 表 1氏滚管法优缺点 . 8 表 2料描述 及常规成分营养价值表 . 15 表 2料脂肪酸组成及含量 （ g/100 . 17 表 2料脂肪酸饱和度比较（ g/100 . 18 表 2料原料粗脂肪含量及主要脂肪酸组成（ g/100 . 20 表 3粮的组成及营养成分 . 24 表 3验 日粮 脂肪酸 的组成 . 25 表 3同日粮处理对瘤胃内环境各指标的影响 . 27 表 3同日粮处理对纤维素酶及脂肪酶活性的影响 . 29 表 4同日粮处理对瘤胃微生物数量的影响 . 36 表 4同时间点对瘤胃微生物数量的影响 . 37 表 5胃细菌 应的引物和模板 应条件 . 41 表 5瘤胃细菌定量结果 . 48 V 图 目 录 图 1量原理 . 11 图 1t 值的确定及未知样品定量 . 11 图 1验技术路线 . 13 图 2品脂肪酸分离色谱图 . 16 图 2料中 肪酸含量比较 . 19 图 2料中 肪酸组成及含量 . 20 图 3同处理对奶牛瘤胃 态变化的 影响 . 26 图 3同日粮对肉牛瘤胃氨氮浓度的影响 . 27 图 3同时间点瘤胃发酵液乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及总 度变化趋势. 28 图 3同时间点总纤维素酶活性及脂肪酶活性的变化趋势 . 29 图 5牛瘤胃微生物总 . 44 图 5用引物 增产物电泳图 . 44 图 5种细菌 增产物电泳图 . 45 图 5菌蓝白斑筛选图 . 45 图 5性克隆的 定 . 46 图 5胃中 增曲线及相对应的熔解曲线 . 47 图 5同处理瘤胃细菌 量的相对比例 . 49 文 缩略表 英文缩写 英文 全称 中文 名称 性 洗涤纤维 解厌氧弧菌 苄青霉素 纤维丁酸弧菌 基对 轭亚油酸 六烷基三甲基溴化铵 性梯度凝胶电泳 in 乳日龄 ry 物质 ry 物质采食量 二胺四乙酸 肪酸 纸纤维素酶 珀酸丝状杆菌 丙基 长链多不饱和脂肪酸 乳脂降低综合症 大可能计数法 不饱和脂肪酸 性洗涤纤维 不饱和脂肪酸 胃白色球菌 胃黄化球菌 和脂肪酸 度梯度凝胶电泳 挥发性脂肪酸 饱和脂肪酸 发性脂肪酸 43中国农业科学院博士学位论文 第 一 章 绪论 1 第一章 绪论 究目的和意义 典型牛乳脂中，饱和脂肪酸（ 单不饱和脂肪酸（ 多不饱和脂肪酸（ 比例分别为 65 70%、 30%左右和 5%以内。与人乳相比，牛乳脂的不饱和脂肪酸（ 量较少，尤其是 比例低，人乳中 比例高达 15%。为了降低乳脂中饱和脂肪酸的比例，人们进行了大量的研究。 （ 1996）报道 ， 对奶牛日粮进行调控可增加乳脂中不饱和脂肪酸比例 ， 降低血浆中总胆固醇与低密度脂蛋白浓度。乳脂的质量与组成受日粮中油脂的来源及其加工保护（过瘤胃）方法与添加量、碳水化合物的来源与水平、蛋白质的来源与水平、营养性添加剂与非营养性添加剂等因素的影响。通过调控日粮可明显改变乳腺从头合成的短链与中链 脂肪酸和乳腺中存在的来自日粮与微生物的长链脂肪酸的比例平衡。很多研究表明奶牛日粮中添加油菜籽、大豆和亚麻籽或它们的油，牛奶中 含量减少， 、 、 、 中的一种或几种的含量增加。 2000， 2002）和2001）研究报道 向奶牛日粮中添加植物油除了能增加日粮能量浓度外，还能通过瘤胃微生 物代谢作用改变乳脂肪酸组成，增加有益于身体健康的多不饱和脂肪酸 如共轭亚油酸（ 量 。 1999）， 2000）及 2001） 研究证实 肪酸也与人身体健康有关。许多研究表明给奶牛 饲喂富含亚油酸和亚麻酸的豆油、胡麻油或油籽能够提高乳脂 肪酸。 然而添加过多的油脂可在不同程度上影响瘤胃发酵，对瘤胃 生物的生长、瘤胃蛋白质降解率、淀粉消化、挥发性脂肪酸产生的 总量、乙酸与丙酸的比例、甲烷的产生、矿物质的利用及 纤维素的消化等都有影响 （ 1996； 996），进而降低 奶牛干物质采食量和乳脂率 （ 1994； 2005） 。 研究证实奶牛日粮中 添加过多的油脂可 能对瘤胃微生物具有抑制甚至毒害作用 （ 1987； 993； 1998） ，从而降低细菌和原虫的数量 （ 1991； 001） 。 研究表明尤其是添加胡麻油更能显著降低绵羊瘤胃消化和减少瘤胃原虫数目（ 1982； 1983； 1994） 。 1988） 假定如果日粮中含有较高的粗饲料，则会削弱不饱和脂肪酸抑制瘤胃消化的负效应，因为粗饲料能促进瘤胃正常的蠕动。 因此，合理选择油脂种 类和添加水平以及日粮中粗饲料占的比例尤为重要。 微生物是反刍动物与日粮之间的联系纽带。 1996） 认为日粮中添加植物油对瘤胃微生物有毒性 ， 而氢化可以降低不饱和脂肪酸对微生物的毒性。不饱和脂肪酸在瘤胃的氢化是依靠两组细菌共同完成。 我们对于瘤胃微生物组成的大多数知识都通过传统培养方法 得到的，但 自然界中还有很多微生物不能人工培养，称为不可培养微生物 ； 并且，已知的种群由于培养的条件不适合或者进入了一个不能培养的阶段，而未知种群由于缺乏适合方法而没有培养（ ， 1995）。这 表明以形态为基础表现出的类型不能充分地用于微生物的分类和定量 。 对细菌的定量有传统和现代分子研究的两大类方法，其中，传统的方法包括经典的亨氏滚管法和最大可能计数法 ，但它们测定瘤胃 微生物总数的结果可能偏低。由于瘤胃微生物的复杂多样，以及大多数是兼性和厌氧性微生物， 体外培养困难，极大地阻碍了对瘤胃微生物中国农业科学院博士学位论文 第 一 章 绪论 2 的研究。 因此，建立一种准确、快速、高效的瘤胃微生物定性及定量评价方法，对于促进瘤胃微生物研究具有非常重要的意义。 由于任何一个细胞都含核糖体， 进化守恒的特性 （ ， 1986； ， 1992； ， 2003） ，建立在 16S/18现代分子技术在不需要培养微生物的条件下，不仅能用于描述分子特性，而且能检测数量和提供用于预测自然进化关系的分类方法 （ ， 1989； ， 2000； ， 2003； ， 2001； ， 2004） 。 16S/18法已成功用于瘤胃环境研究而且很快获得认可 （ ， 1995； 1997； ， 2001； 1993； ，1997； 1996）