【毕业学位论文】（Word原稿）青枯菌II 型分泌系统Gsp蛋白互作分析植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 青枯菌 分泌系统 析 I I 要 细菌通过设计精巧的蛋白传输系统，泌出毒性因子和效应子，与寄主进行分子交流。 其中，分泌系统广泛存在于 革兰氏阴性细菌中。 分泌系统主要以分泌途径转膜蛋白 （ 因簇为中心。 植物细菌性青枯病是我国和世界范围内广泛分布和发生的一种重要细菌病害 ， 青枯菌 分泌系统 与致病蛋白的分泌密切相关。 本 研究 利用 酵母双杂交技术 ， 对 青枯菌 000菌株 分泌 系统 白 之间的 互作关系 进行了分析研究 。 根据 青枯菌 分泌系统 中 12 个 因 的上下游序列， 利用 引物设计 软件，设计出 12 对最佳 因扩增引物。克服 了 因 量偏高（ 、 难以 获得 扩增 产物 的困难，通过 系条件 优化， 成功 地 完成了 青枯菌 000 菌株 分泌系统 12 个 因的克隆 。 分别 将 12 个 因 连接到 酵母双杂交研究体系的 诱饵载体 捕获载体 成功地 构建了 因 诱饵库和捕获库。 经过 序列 测定， 证明 12 个 因 读框正确 ， 保障了 因在 酵母体系中 正确的表达 。 成功地 将 诱饵库和捕获库 共转化 到 母 菌株中 ， 发现在酵母双杂交体系中， 和； 和 ； 和 ； 和 及 和 蛋白 之间 可能 存 在 相互作用 。 经载体互换 后 ，证实了 和 ； 和 ； 和 蛋白 之间 互作的真实性。 本研究首次将酵母双杂交技术引入到青枯菌 分泌系统 白的互作 研究 中， 实验得到了 三对蛋白 间的 互作 结果 ，证明该技术在青枯菌 白 互作关系 研究中的可行性 。 人类致病细菌 分泌系统 中 在 细胞 内膜 以 复合物 形式存在 ， 构成组装其他分泌元件的平台。青枯菌 白互作分析与上述 研究结果 一致 。 围绕青枯菌致病蛋白分泌密切相关的 分泌系统 的 研究 ， 将为解析 致病蛋白的分泌调控途径，寻找阻断青枯菌致病蛋白分泌的作用靶标， 开 辟 控制青枯病 危害的新途径 奠定理论基础 。 关键词 青枯菌 ， 分泌系统 ， 白 ， 酵母双杂交 ， 蛋白互作 he by of by I is is of I is of of in I is of . In sp of I . 000 by to of we 2 of C of ) in CR we 2 by CR 2 2 by be in In , , , , , , We to sp of I . sp is an on sp . In I of , a in is as a of of in on I . of . of of to I 录 第一章 绪论 . 1 细菌的分泌系统 . 1 分泌系统的研究现状 . 2 植物青枯菌 分泌系统的研究现状 . 7 本论文研究的目的和意义 . 9 第二章 青枯菌 分泌系统 因簇 12 个基因的 克隆 .材料 . 10 方法 . 10 青枯菌 000 基因组 取 . 分泌系统中 12 个 白编码基因的克隆 . 11 结果与分析 . 14 青枯菌 000 基因组 提取 . 14 12 个 因的引物设计 . 14 12 个 因的 增 结果 . 15 组质粒双酶切鉴定 . 17 组质粒测序鉴定 . 17 小结及讨论 . 18 第三章 青枯菌 分泌系统 因诱饵库和捕获库的构建 .材料 . 19 方法 . 19 粒 载体的制备 . 19 粒载体的制备 . 20 质粒的酶切鉴定 . 21 载体双酶切制备 . 21 因的制备 . 22 诱饵库和载体库的构建 . 23 测序验证各基因的读框 . 24 结果与分析 . 24 构建 因 诱饵库和捕获库的流程图 . 24 V 质粒载体的酶切鉴定 . 25 获得了具有 和 双酶切的线性诱饵及捕获载体 . 25 因 双 酶切制备 . 26 构建成功 饵库及捕获库 . 28 因 插入片段的读框验证 . 28 小结及讨论 . 29 第四章 白之间的互作分析 .材料 . 31 方法 . 31 酵母菌株感受态细胞的制备 . 31 诱饵库和捕获库共转化 酵母 . 32 酵母质粒 取 . 33 质粒 增 . 33 因表达 验证 . 34 白互作的再次验证 . 35 结果与分析 . 36 共转化酵母筛选流程图 . 36 互作蛋白编码基因的确定 . 37 因表达 再 验证 . 37 白互作的再次验证 . 38 小结 及讨论 . 39 第五章 结论及讨论 .结论 . 40 讨论 . 41 参 考 文 献 . 表 . 谢 . 者 简 历 . 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 43半乳糖苷 二甲基亚砜 重蒸馏水 肠杆 菌 养基） 聚合酶链反应 种高效克隆 物专用载体 二烷基磺酸钠 冲液 苄青霉素 那霉素 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 细菌的分泌系统 病原细菌与寄主植物分子互作过程，产生各种与致病有关的毒性因子和效应子（ et 2000） 。细菌通过设计精巧的蛋白传输系统，泌出毒性因子和效应子，与寄主进行分子交流 细菌的分泌系统是转移所分泌蛋白和其它分子最重要的系统，主要有 4 种类型的分泌系统： 型分泌系统 I 型分泌系统装置相对简单 ， 它主要涉及分泌毒素类物质，如溶血素（ ， 根瘤菌素（ （ 1998） 。它的显著特征是 白的存在（ 涉及通过 解提供能量的各种化合物的输入和输出 （ et 2004） 。 通过 I 型分泌途径分泌的蛋白质缺乏 利用 径，这些蛋白质完全通过周质，直接从胞质分泌出去。 在已报道的所有细菌基因组中均存在 I 型分泌系统。 分泌途径广泛存在于革兰氏阴性细菌中，包括人类、动物和植物病原细菌。 它 是革兰氏阴性菌中的常规代谢途径，向细胞外分泌各种蛋白，包括胞外酶，蛋白酶，毒素和毒性因子 ， 这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主细胞，引起组织坏死和病害 （ 2001; et 2003）。 分泌系统主要以分泌途径转膜蛋白 （ 因簇为中心， 主要 涉及 12 15 种蛋白的复杂机制，通过 二步转移将蛋白质从细胞内运输到细胞外 （ 1998） 。 动物和植物细菌分泌各种毒性蛋白主要通过保守的 分泌系统，此系统是植物病原细菌致病机制研究的焦点和热点，与细菌的致病性关系最为密切，在细菌致病过程中起重要作用。 它 是多种人类和植物病原物蛋白质从周质进入寄主的主要途径（ 1997; et 2003）。 系统是由 基因编码的 ，所分泌的蛋白主要有 毒蛋白 （ et 2003） 。植物病原细菌的 因簇由 20 多个基因组成，其中有大约11 个 因在几乎所有 分泌系统的细菌中是保守的（定义为 因），这些 因的主中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 绪论 2 要的功能是组装复杂的菌毛 （ 和分泌效应子蛋白 （ et 2003; et 2003） 。其中，分泌到细胞外 因有 , , 和 。 是 毛结构组成成分，在外膜的蛋白 控制由 ， 和 构成的植物的反应调控链。 蛋白构成另一个依赖于细菌营养和代谢情况的 导的信号途径（ et 2000） 。 分泌系统装置与 毛相连横跨细菌内外膜，菌毛穿过植物细胞壁，直接把分泌蛋白分泌到植物细胞内。分泌的 毒蛋白与寄主植物抗性蛋白专一性的识别 ， 在抗病寄主和非寄主植物中诱导快速定位程序化细胞死亡的反应（ et 2002; et 2004） 。 分泌系统 类似一个大的菌毛结构， 横跨内外膜， 主要涉及 蛋白和 大分 子的输出及 靶定寄主细胞。与细菌的结合（ 关，负责质粒在细菌中的移动。 该途径的成分也包括一个带有 点的蛋白质和定位在外膜的蛋白质（ 1998）。 分泌途径广泛存在于革兰氏阴性细菌中，包括人类、动物和植物病原细菌。 有 研究发现当 ，细菌仍然具有侵染番茄根和系统定殖维管束的能力（ 2001）。所以 分泌系统对病害的形成也同样具有重要的作用，如胞外多糖 多种细胞壁降解蛋白 产生 （ 2004） 。研究发现胞外蛋白对革兰氏阴性细菌的毒性显得尤为重要，如萝卜软腐菌（ 用 I 途径分泌大量的果胶酶和纤维素酶，导致典型的软腐症状 （ et 1997; Hu et 1992）。 I 型 和 分泌途径通过特殊的装置将蛋白从细胞内一步转移到细胞外，而 分泌途径将蛋白质从细胞内运输到细胞外的则需要二步转移 ：第一步，将未折叠的胞外蛋白通过 1993） 或 et 2001） 系统穿过内膜转移定位输出到外周胞质中； 第二步，蛋白质自然折叠，并被 白识别，通过外周胞质在膜外转移定位 （ et 1998; et 2001） 。这种途径的大多数成分是内膜蛋白，具有细胞质的或外围与内膜相连的 分。开始人们只发现 统，后来有研究表明有些是通过 统（ 例如铜绿假单胞菌中磷酸脂肪酶分泌到胞外就是通过 统（ et 2001）。带有 赖信号肽（ 就通过 统进入 周质，带有 号肽（ 就通过 统进入 周质（ et 2001）。完整的外膜蛋白也是 分泌装置的一部分，在周质和细胞外部 之间成为一个通道。 由 分泌系统泌出的蛋白质包括蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸酯酶、酯酶和毒素（ et 1997; et 2000）。这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主细胞，引起组织坏死和病害。 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 绪论 3 分泌系统主要以分泌途径转膜蛋白 （ 因簇为中心，此基因簇共由 12 15 种蛋白组成 （ et 2004; 2001） ，分别按字母顺序命名为 S。在几个主要的植物病原细菌中均存在同源序列，但命名不同（如表 1 表 1同菌中 因的 命名 of in b 国内外围绕 植物病原细菌 统的研究焦点 在 中 统 具有种的专一性，通过 统分泌多种胞外蛋白 ， 一个种（ 产生的胞外蛋白不能由另一个种 （ 的分泌系统分泌到胞外，即有种属特异性 （ et 2001） 。研究发现， 统在分泌不同的胞外蛋白时，在 和 上有不同的靶定信号区域。这 2 种细菌并不能分泌其他种的细菌分泌的果胶裂解 酶（ ，认为在蛋白之间存在专一性的信号识别与交流 （ et 1996; et 1998） 。 病 蛋白之间的互作 研究 被泌出的胞外蛋白与 因簇结合区域的确定。 过 分泌系统分泌纤维素酶 2 个结构域组成，一个大的 390 个氨基酸 ） 和一个小的 62 个氨基酸 ） 及中 间的连接区域 （ 。结合突变和结构分析探明了 构 /分泌间的关系，不同位点的氨基酸发生突变，对蛋白进行有效的折叠及被结合后分泌到胞外具有很大的影响 （ et 2000, 2001） 。 E. 菌所分泌的多聚半乳糖醛酸酶 （ 含有 2 个主要的区域，一个是在靠近 42 和369 位氨基酸之间，另一个是 84 和 135 位氨基酸之间大的中心环区域，这些区域在促进蛋白分泌到胞外是必不可少的，认为这些区域均与 相互作用有关 （ et 1995; 2002）。这基因 病原 细 菌 参考 文 献 Py et 1999,2001; on et 2000,2001; et 2001; a ez et 1999,2000 et 1999 et 2001 p v et , 2002; et 2001; m g et 1994; g et 2003 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 绪论 4 是第一次鉴定出具有三维结构的与 互作用的 这两个 结构上是完全不同的，认为在 置中也存在两个截然不同的识别区域。 因簇中不同基因的 功能 研究 1） ：是唯一位于外膜上的最大的一个蛋白， 形成一个分泌孔道， 与转移通道功能有关（ 2004） ，也在识别被泌出蛋白中起重要作用 （ 2002; et 2002） 。 与 形成 外膜孔（ Py et 2001）。 2） ：跨越在内、外膜之间，与外膜上的蛋白 可发生直接互作，它与 属于分泌素（ 族，专门负责与底物进行识别或组装 （ et 2000, 2004, 2005） 。 3） ： 蛋白具有 2 个与 合的 为 被分泌蛋白 的转移提供能量（ et 1998; et 1997） ， 对于蛋白分泌起重要 作用 （ 2004） 。 4） ：是广泛分布的胞质膜蛋白，它的 种结构是由亲水性图分析推断的，通过 E. 交分析的（ et 1997; Py et 2001）。 5） , 和 ：这 3 个蛋白位于内膜上，相邻排列。 , ， 和 为组装其他分泌元件的平 台（ Py et 2001） 。 与 蛋白可能控制着分泌通道的开关 （ et 1999）。 蛋白在复合体的形成过程中起重要作用（ Py et 2001）。 复合物据推断至少 500Py et 2001）。这个复合物可控制分泌孔道的开关，还能为外膜的转移位点提供能量（ et 2000）。 6） ， ， ， 和 ：这五个蛋白在 周质中形成复合体， 与形成大分子结构的将蛋白泌出胞外的、可固定在各种固体表面的 享着序列相似性，故称为假菌毛（ et 2004, et 2000） 。它与外膜孔直接接触 （ et 1998; et 2000; Hu et 2002） 。 7） ：是一个 酶，裂开 , H, I 和 J 的信号肽序列， 产生和修饰两类亚基， 置的假菌毛和 分泌系统的菌毛，它在 置中没有结构上的作用，所以应该单列出来 （ Py et 2001） 。 8） ：是一个小的外膜脂蛋白，它只在一些细菌中存在，推测它有助于 在外膜上的定位 （ et 1996; et 1998） 。 9）至今已证明 只是在一半的 分泌系统中存在（ et 2004）。 和 2004） 。 中国农业科学院 硕 士学 位论文 第一章 绪论 5 由以 上可以看出， 制是由 3 个 成，外膜孔、一个 外周胞质的假菌毛和一个内膜平台 ， 如图 1扑和生化研究表明 、 、 、 、 、 、 、 都有膜内嵌区域和大的周质区（ et 1997; et 1997）。 图 1I 型分泌系统的结构推测图 ed o f th e I 物病原细菌 I 分泌系统 结构及泌出机制的研究较 人类致病细菌的研究相对落后，目前已基本明确了 P. 因簇中的 12 个基因所编码的蛋白的功能，并 初步绘制出了此系统泌出蛋白的步骤 ， 如图 1但其中涉及的许多细节尚不清楚。 不同细菌属中 同源性分析及功能比较 和 属于分泌素家族 （ 的成员，专门负责与底物进行识别或组装，利用（ 为模式细菌 （ et 2003, 2005） ， 测定涉及 （ 成员 ） 专一性的结构域，通过构建 （ （ 间的杂交 ， 鉴定出 35 个氨基酸是不可交换的区域，此区域影响 、 Z 合体的稳定性分泌 （ et 1999） 。显然 和 分别含有功能相同，但结构不同的 构域 ， 这 2 个结构域之间是可以交换的 （ et 2002） 。 研究发现亲缘关系较近的种之间 因的同源