【毕业学位论文】（Word原稿）玉米干旱胁迫相关基因ZmMADS4的克隆与分析作物种质资源硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 玉米干旱胁迫相关基因 克隆与分析 I 摘 要 因是一个大的转录因子家族， 广泛存在于人 、 动物和植物中。 因在植物个体发育和 花发育过程中起重要作用。 拟南芥中 个亚家族 家族转录因子具有典型的 M、 I、 K 和 C 结构域。 在本实验室前期工作中，发现了一个受干旱胁迫诱导的 列，与 因 相似 ，命名为 为了更好的研究 该 因 在逆境应答中的作用，我们根据单子叶植物 守序列设计含有 起始 密码的简并引物，利用 3隆出 该基因的编码区， 3)尾。编码区长 7353 206因编码区编码 244 个氨基酸 ，分子量 生物信息学分析，该蛋白有一个典 型 构域 ，证明 因是因家族的成员。亚细胞定位预测 白定位在细胞核中，暗示该蛋白 可能在细胞核中发挥其功能。 绿色荧光蛋白 （ 瞬时表达实验进一步证明 白定位在细胞核中。 简并引物扩增 后连接转化所得的大量克隆中，还有 6 个 因，分别命名为 通过 对分析，这 7 个 基因编码蛋白的 与拟南芥的 有高度的 一致性。说明这 7 个基因是 族成员。 交分析表明， 开花期 土壤干旱诱导 因 在玉米幼穗和花丝中表达量先增加后降低的趋势。 析结果显示，基因 苗期逆境处理下有相似的 反应 ，即在干旱、高盐、 冷处理条件下被诱导表达，并有表达差异。 因在干旱、 冷处理条件下表达都有差异。 因 只在苗期干旱处理条件下有表达差异，其它 3 个基因都无表达差异。 构建 基因 义表达载体转化野生型拟南芥， 转基因 种子在含有 200 露醇及 100 养基上发芽率高于野生型种子。土壤干旱条件下，转基因 拟南芥叶片脯氨酸含量以及叶绿素含量明显高于野生型拟南芥，这一结果 表明 因 参与 植物对渗透胁迫的应答。 关键词 ： 玉米 （ .） ， 干旱胁迫， 差异表达 is a It is in in to , M a I k In we a by in To in to of 206735 to a 44 an a is a of to At of in by in by BA 4 ). in by BA by in NA a on or of of of an in to .), 录 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 物抗旱性的生理生化机制 . 1 孔调节 . 1 透调节 . 2 素调节 . 2 氧化防御系统 . 2 录因子的结构及其生物学功能 . 2 等植物的转录因子的功能结构域 . 2 等植物的转录因子的生物学功能 . 3 因研究现状 . 3 第二章 因的克隆与分析 . 5 因的克隆 . 5 言 . 5 料和方法 . 5 验方法 . 8 果与分析 . 10 论 . 17 用 因亚细胞定位 . 18 料和方法 . 18 果与分析 . 19 论 . 20 因在不同逆境下表达量分析 . 21 言 . 21 验材料与方法 . 21 验方法 . 22 果与分析 . 23 论 . 26 第三章 因转化野生型拟南芥 . 27 言 . 27 验材料与方法 . 27 验材料 . 27 验方法 . 27 果与分析 . 30 义表达载体的构建 . 30 南芥转基因植株的筛选 . 32 南芥转基因植株的检测 . 32 露醇、 转化的拟南芥种子萌发的影响 . 33 旱胁迫对转基因拟南芥叶片脯氨酸和叶绿素含量的影响 . 34 论 . 36 四章 其它 6 个 因的扩增和分析 . 37 它 6 个 因的扩增 . 37 个基因的分析 . 37 个 因编码氨基酸序列分析 . 37 个 因编码蛋白生物信息学分析 . 37 个 因编码蛋白与 码蛋白比较分析 . 38 6 个基因不同逆境下表达量分析 . 47 料和方法 . 47 果与分析 . 47 论 . 48 第五章 全文结论 . 50 7 个 因的克隆与生物信息学分析 . 50 7 个 因 在不同逆境下表达量分析 . 50 因转化野生型拟南芥分析 . 50 参考文献 . 51 致谢 . 57 作者简历 . 58 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 g 克 l 升 基酸 苄青霉素 血清白蛋白 碳酸二乙酯 硫苏糖醇 肠杆菌 EB 化乙锭 乙二胺四乙酸 丙基 半乳糖苷 -吗啉代丙烷磺酸 放阅读框 反转录聚合酶 链式反应 十二烷基硫酸钠 - 溴 哚羟甲基氨基甲烷 使 椰菜花叶病毒 标准柠檬酸钠 of 端快速扩增 落酸 福平 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 言 干旱对农业生产的威胁是一个世界性的问题。干旱是导致农作物减产的主要原因之一，全世界平均每年因干旱造成的损失相当于其它非生物胁迫造成的损失之和 （李智念， 2003） 。全世界干旱和半干旱地区遍及 50 多个国家和地区，其总面积占陆地总面积的 ；我国干旱、半干旱耕地面积占总面积的 51 。因此，如何克服干旱，如何利用和开发我国上亿亩的干旱、半干旱耕地，提高作物产量，就成为我 国农业生产中十分迫切的问题。 玉米（ .）是重要的粮食作物之一，近年来，国内玉米总产已经超过小麦，成为我国第二大粮食作物。但是，我国的玉米生产受到干旱等非生物胁迫的影响非常严重。据报道，我国约有 60的玉米面积受到干旱胁迫，每年因干旱而减产 15 20。因此，解决干旱对玉米产生的影响是当务之急。 在过去的一个世纪里，植物生理学家、分子生物学家和育种家等在植物抗旱性研究方面取得了显著进展。 物 抗旱性的生理生化机制 植物在水分胁迫下有各种各样抵抗或 者 适应干旱的本领。抗旱性是指作物在 土壤和大气干旱条件下生存和形成产量的潜力。作物在干旱条件下存活不一定和高产量相联系。在水分匮乏的环境里，作物常通过部分或完全保护生命的方式，如减少叶面积、抑制代谢作用等继续存活。这类存活机制往往与降低产量有关，在作物抗旱品种资源中，抗旱性较强的基因型其农艺性状较差，表现低产，难以直接利用。作物的抗旱性是由多基因控制的，可以通过不同的途径来抵抗或适应干旱。 为作物适应干旱的机理可以分为三类：避旱、御旱和耐旱，其中又把御旱性和耐旱性统称为抗旱性。 对作物适应干旱的机理进行 了更进一步的分析之后指出：避旱、高水势下耐旱和低水势下耐旱是作物适应干旱的三种方式。避旱是通过调节生长发育进程避免干旱的影响，高水势下耐旱是通过减少失水或维持吸水达到的，低水势下耐旱的途径是维持膨压或者是耐脱水或干化。其中减少失水或耐干化的耐旱性是以降低产量为代价的。 在作物形态上，表现抗旱的形态结构特点如根系十分发达、叶子窄小，叶片较厚，叶色浓绿，叶片直立；叶片与茎杆夹角较小、叶片具有表皮毛和蜡质、干旱时不卷叶、植株萎蔫较轻等；在生理功能上大多数植物通过渗透调节、气孔行为、 脱落酸 (量的变化、抗氧 化防御系统以及水通道蛋白等途径提高细胞对干旱胁迫的抵抗能力。 孔调节 气孔作为叶片与外界环境水分和气体交换的门户，它不仅影响玉米的光合作用和蒸腾作用，而且当环境缺水时，植物因吸水不足或不能弥补蒸腾失水常发生组织脱水 。 植物可通过气孔调节减少蒸腾从而减少或避免旱害损伤。通常气孔蒸腾可占植株总蒸腾量的 80 90 。 因此 ， 减少气孔蒸腾是植物控制失水和抗旱的一个关键 (2004)。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 透调节 植物通过渗透调节作用可在干旱条件下使细胞维持一定的膨压 ， 从而维持细胞生长 ， 并保持气孔开放和光 合作用等生理过程的正常进行。在干旱条件下 ,渗透调节的关键是细胞内溶质的主动积累。对干旱条件下溶质积累的生物学功能有两种解释 ， 一是认为溶质本身作为一种渗透剂进行渗透调节 ， 从而增强植物保水的能力 ,稳定体内的渗压平衡 ； 二是认为积累的溶质可能作为一种溶剂代替水参与生化反应。在这种意义上 ,它们又被称为低分子量的分子伴侣。如脯氨酸和甜菜碱 ，它们的主要特点分子量小，易于溶于水，在生理 围内不带静电荷，可被细胞膜保持。引起酶结构变化的作用最小，生成迅速 (2005)。 素调节 内源激素是植物体生命活动 的调节者 ， 在植物遭受逆境胁迫时 ， 激素起着重要的调节作用 。在干旱胁迫下 ， 植物通过内源激素的变化如 生长素（ (1980)和 细胞分裂素 (1985)浓度的 降低 和 1997)浓度的升高来调节某些生理过程以达到适应干旱的效果。随着水分胁迫时间的延长 ,玉米幼苗 度变化不显著 , 量逐渐降低 ,赤霉素 (乙烯含量先升后降 , 多胺含量则逐渐升高。 氧化防御系统 超氧化物歧化酶（ 过氧化 氢酶（ 过氧化物酶（ 是生物体内的保护 酶系统 (1993; 梁新华 ， 2006)， 在清除生物自由基上担负着重要的功能 ， 将 超氧化物阴离子自由基 2而 将 2O， 三者协同作用可使自由基维持在一个较低水平 ， 从而避免膜伤害 （ 2005; 曹帮华 ， 2005） 。 录因子的结构及其生物学功能 等植物的转录因子的功能结构域 转录因子也称为反式作用因子 , 是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用 的 通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用 , 激活或抑制转录。 转录因子在高等植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的调控作用 。 典型的高等植物转录因子含有 转录调控域（ 寡聚化位点 （ 和核定位信号 （ ，转录因子通过这些功能区域与启动子顺式元件作用或与其他转录因子的功能区域 相互作用来调控基因的转录表达 (1997; 1992)。 典型的高等植物转录因子 1991; 2002; 2003)，锌指结构域 (1998; 2003)， 1995; 2003), 1997)， 1997)等。相同类型转录因子 此， 这段氨基酸序列决定了转录因子的特异性。 转录调控域包括转录激活域和转录抑制域两类，它们决定了转录因子功能的差异。同类转录中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 因子的主要区别在于它们的转录调控域各不相同 (1998)。 寡聚化位点是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守，大多与 核定位信号是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进入细胞核的过程受该区段控制。 等植物的转录因子的生物学功能 转录因子在高等植物的生长、发育、形态建成，以及生物 和非生物胁迫等环境反应中起着重要的调控作用 (杨致荣 ， 2004)。 在 高等植物的生长发育和形态建成的 复杂 过程 中 ， 蛋白质起着主要作用，通过 它们之间的互作，调控 基因 的 表达。 近年来发现的与植物生长发育有关的转录因子主要有 族和 族等。 构域为共同特征，广泛参与植物发育、代谢的调节和植物激素的信号转导。 对拟南芥 转录因子 研究表明， 能参与植物的细胞周期调控（王栋等 ， 2001） ；对拟南芥中编码 转录因子的 )基因研究表明， 制细胞和植物的形态建成 （ 2002） 。 另一类庞大的基因家族，在人、植物及酵母中均存在。该类基因的结构、表达，以及功能进化与植物花器官发生、花形态多样性的遗传机制和进化规律有密切的关系。 对拟南芥和牵牛花的研究表明，大多数 因参与控制花、根、叶、果实、种子和胚胎的发育 ，有部分基因在营养器官中表达；拟南芥中还有有些基因控制表皮毛发育 （ 2003; 1995）。 转录因子所介导的基因表达调控在植物抵御各种环境胁迫的反应中也具有重要的生物学功能。已鉴定的参与植物环境胁迫响应的转录因子及家族有 和同源域转录因子家族 ( 等 (王计平 ， 2006)。这些转录因子组成调控网络 ,精细调控植物胁迫反应中各种相关基因的表达。 因研究现状 植物中的 因是一个序列特异的调节基因家族。它和它所编码的蛋白转录因子在植物的生长发育过程中起着重要的调节作用。 因最先在酵母的 因、拟南芥的 基因、金鱼草的 基因和人的 因中被鉴定出来，它们编码的蛋白质具有共同的保守序列，即均在 N 端含有一个约 57 个氨基酸的保守区域。所以根据这四个基因的名字的第一个字母命名为 因家族，将该保守区域命名为将具有该区域的基因统 称为 因 (1996; 1992; 1995)。 因存在于整个真核生物界，该家族的成员编码 白，均为转录因子。植物的 录因子主要由 5 个部分组成 (2001; 1998)。其中 由中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 约 57 个氨基酸组成的高度保守的结构域，在至今发现的所有 子中该区域有 9 个氨基酸完全一样。研究表明它是一个序列特异的 合基元 (1995)。 约 70 个氨基酸组成， 类似于角蛋白的能够形成具有双亲螺旋的保守二级结构的区域，是植物子的特征序列，也是发生二聚体化的结构基元。 I 区位于 间，是由 31 35 个氨基酸组成的含有较多亲水残基的非保守区域。 C 末端位于 游，是由约30 个氨基酸组成的富含疏水残基的非保守区域。 N 末端是位于 游富含碱性氨基酸的亲水结构域。这 5 个部分在蛋白因子的二聚体化及靶 二聚体的结合中起着各自不同的功能。 目前 因 的作用 在植物生殖发 育研究中 已经得到证实 ，特别是 在 有关高等植物花发育基因调控的研究 (田波 ， 2005; 1995; 2001)，但对营养器官的发生与发育、植株形态发生、抗逆性等过程的 作用 研究较少 (程震龙 ， 2002; 1995; 1999)。酵母 族中基因 码的 白参与渗透胁迫信号传导，但在植物中，还没有类似报道 (2000)。 玉米中， 因家族中， 基因 2004; 2000)， 受精及早期胚胎发育中特异性表达 (2001)，和 根组织中特异表达 (2005; 2002)。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第二章 因的克隆与分析 5 第二章 因的克隆与分析 因的克隆 言 本实验室通过抑制差减杂交（ 方法，已经构建了 玉米 花期干旱胁迫条件下 幼穗和花丝 的差减文库 ， 该文库含有 361 个 2007）。 对所获得的 比对分析，发现一个 因 ，与水稻和拟南芥中的 因 具 有较高的同源性。 前人的研究表明， 因是一类序列特异的多基因家族，几乎遍布整个植物界，如拟南芥、金鱼草、玉米、小麦、高梁、番茄、矮牵牛和油菜等。在植物的不同部位和不同的发育阶段均发现因表达。其 编码蛋白 花发育相关的一类转录调控因子 , 它以二聚体化的形式通过其保守结构域与特定的序列相结合 来调控基因的表达，在决定植物开花时间和花形态建成中均起着非常重要的作用（ 1995， 1999），也参与植物的 营养生长、子房发育、种皮发育、根的形成、胚形态建成、共生诱导等（段远霖，2001） ；在番茄中，低温诱导 因 表达，导致花发育异常（ 998）；酵母中， 录因子 在应答 氧化胁迫中起重要作用（ 1997） ;拟南芥中，作为信号分子的 因 表达 （ 1998） ；在水稻愈伤组织中的特异表达调节植物培养细胞脱分化与再分化过程 , 因其产物可能是传递激素信号到达靶基因的中间环节 （ 王光清 ， 1997）。 为了进一步研究该 库中 因的功能及表达特性，克隆该基因的全长 研究利用 of 法，扩增出该基因的全长 利用转基因技术研究该基因的功能和表达模式。 料和方法 试材料 以抗旱玉米自交系 实验材料。培养箱中用无菌水及纱布发芽，栽于规格一致的 18个瓦盆中， 2 颗 /盆，种植于温室 (温度、湿度和光照条件可以控制 )，栽培载体为土壤、蛭石和有机肥（ 3： 2： 1）。每 6 个瓦盆为一组，且要求长势一致，共分为 3 组，每组设 3 个对照和 3 个处理，共 3 次重复。正常灌溉至吐丝期开始对处理进行