【毕业学位论文】蜡蚧轮枝菌抗药性诱变效应研究硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 蜡蚧轮枝菌抗药性诱变效应研究 士研究生 ： 扈新萍 指 导 教 师 ： 谢 明 副研究员 申请学位类别 ： 农学硕士 专 业： 生物安全 研 究 方 向 ： 杀虫微生物 培 养 单 位 ： 研究生院 植物保护研究所 2006 年 6 月 u 006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知， 除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、 使用学位论文的规定， 即： 中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 蜡蚧轮枝菌抗药性诱变效应研究 论文作者 扈新萍 指导教师 谢 明 培养单位 植物保护研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 刘杏忠 研究员 博导 中国科学院 微生物学 许 雷 副研究员 硕导 中国农业科学院 生物化学与分子生物学 评 阅 人 答辩 主席 张芝利 研究员 博导 北京市农林科学院 植物保护 高希武 教授 博导 中国农业大学 农业昆虫与害虫防治 谢丙炎 研究员 博导 中国农业科学院 植物病理学 孙江华 研究员 博导 中国科学院 昆虫生态学 彩万志 教授 博导 中国农业大学 农业昆虫与害虫防治 答 辩 委 员 答辩时间、地点 2006 年 6 月 19 日 中国农科院环发所 301 会议室 记 录 刘万学 副研究员 摘 要 蜡蚧轮枝菌 一种重要 的虫生真菌， 可寄生多种害虫， 其制剂在害虫生物防治中已经广泛应用， 防治效果显著。 但蜡蚧轮枝菌对常用的杀菌剂敏感， 在协调虫害生物防治和病害化学防治上有很大的难度。 本研究针对这一问题， 以蜡蚧轮枝菌菌株 出发菌株，以杀菌剂霜霉威为抗性靶标进行诱变实验，探索其抗性诱变育种模式， 选育抗性菌株。 本研究对丰富微生物诱变育种技术具有积极意义， 筛选得到的抗性突变菌株在温室蔬菜生产上具有很好的应用前景， 对促进生物防治技术的推广， 发展无公害蔬菜生产均具有重要意义。通过两年的研究，取得了如下结果。 1. 通过低能离 子束（ N+） 诱变实验， 明确了低能 离子束抗药 诱变的适宜 条件：离子 束能量 30 子密度 11014脉冲频率 011s（磁场 速流强度 2A） 。在此条件下诱变效应为：孢子死亡率为 正突变 率为 正变幅度为 离 子循环诱 变 的累加效 果 不明显， 最 大 598.8 ，抗性比为 变株抗性遗传稳定。 2. 通过紫外线 （ 诱 变 实验， 明确了紫外诱变的适宜条件： 照射距离 45照射时 间60s（紫外灯 源功率 20W， 紫外线波 长 。 此条件下 的诱变效应为： 孢子死 正 突 变 率 正变幅度 紫外循环诱变累加效果明显， 以 4 次循环 最佳，突变株最大 ，抗性比最高为 药 性遗传较稳定。 3. 通过 验 ，明确 了 适 宜条件 ： 理 60酸 缓冲液 条件下的诱变效应为孢子死亡率 正突 变率 3 次循环为宜 ，突变株最 大 ，抗性比为 抗性遗传较稳定。 4. 通过复合诱变实验， 得到 2 个诱变 效果较好的连续性复合诱变模式。 模式一： 针对无抗性基础 的敏 感菌株 （ 具有 紫外诱 变抗 性基础 的菌 株（ ，选用 “N+离子束 +模式较好， 孢子致死率 正 突变率 正突变幅度 ， 抗性比 模式二： 针对具有离子诱变抗性基础的菌株 （ ，选 用 “N+离子束 +外线复合诱变 ”模式较好，孢子致死率 正 突变 率 正突变幅度 ，些模 式下筛选得到的突变株，其抗药性均比单一诱变的高。 5. 在单因子诱变和多因子连续复合诱变的基础上， 设计了多因子间断性复合及二级复合诱变模式 “亚硝 基胍诱变 紫外线诱变 离子束注入诱变 （ 3 因子复合诱变） ”， 实验结果明确了该模式的效应， 各诱变阶段的诱变贡献率依次为： N+离子诱变 （ 三因子 （ 束、 连续复 合诱变 （ 紫外线诱变（ 3 In of is of of is of 3 of 164.4 693.5 , .3 On s is be in 目 录 第一章 绪 论 . 有益微生 物诱变育种技术研究进展 . 1 外线诱 变 . 1 学诱变 . 2 能离子 束诱变 . 4 合诱变 . 6 究热点 . 7 2 立题背景 、研究目的与意义 . 7 题背景 . 7 研究的 目的与意义 . 8 3 研究内容 与技术路线 . 8 要研究 内容 . 8 术路线 . 9 第二章 蜡蚧轮枝菌抗药性单因子诱变效应 .一节 蜡 蚧轮枝菌抗药性离子诱变效应 . 10 1 材料与方 法 . 10 料与设 备 . 10 变方法 . 11 选方法 . 11 变株抗 药性稳定性测定 . 12 变效应 计算 . 12 2 结果与分 析 . 12 能 N+离子束的诱变效应 . 12 化条件 对菌株抗药性提高的作用 . 14 变循环 次数对菌株抗药性提高的作用 . 15 药突变 株遗传稳定性分析 . 16 3 结论与讨 论 . 16 第二节 蜡 蚧轮枝菌抗药性紫外诱变效应 . 18 1 材料与方 法 . 18 品制备 . 18 变方法 . 18 选方法 . 19 变株抗 药性稳定性测定 . 19 变效应 计算 . 19 2 结果与分 析 . 20 外线的 诱变效应 . 20 化条件 对菌株抗药性提高的作用 . 21 i 变循环 次数对菌株抗性提高的作用 . 22 性突变 株的遗传稳定性分析 . 22 3 结论与讨 论 . 23 第三节 蜡 蚧轮枝菌抗药性化学诱变效应 . 24 1 材料与方 法 . 24 品制备 . 24 变方法 . 24 选方法 . 25 变株抗 药性稳定性测定 . 26 2 结果与分 析 . 26 . 26 化条件 对菌株抗药性提高的作用 . 29 变循环 次数对菌株抗性提高的作用 . 29 性突变 株的遗传稳定性分析 . 30 3 结论与讨 论 . 30 第三章 蜡蚧轮枝菌抗药性多因子复合诱变效应 .一节 蜡蚧 轮枝菌抗药性多因子连续性复合诱变效应 . 31 1 材料与方 法 . 31 料与设 备 . 31 变方法 . 32 选方法 . 32 变效应 计算与评价 . 33 2. 结果与分 析 . 33 续复合 诱变对菌株孢子的致死率 . 33 续复合 诱变的正突变率 . 34 续复合 诱变的正突变幅度 . 34 续复合 诱变对菌株抗性提高的作用 . 36 变模式 的优化结果 . 36 3 结论与讨 论 . 37 第二节 蜡 蚧轮枝菌抗药性多因子间断性复合诱变效应 . 38 1 材料与方 法 . 38 料与设 备 . 38 变方法 . 38 选方法 . 40 变效应 的计算与评价 . 41 2 结果与分 析 . 42 合系统 中 菌株抗药性提高的作用 . 42 合系统 中紫外线诱变对菌株抗药性提高的作用 . 43 合系统 中低能离子束诱变对菌株抗药性提高的作用 . 45 合系统 中 “离子 +外线复合诱变 ”对菌株抗药性提高的作用 . 47 断性复 合诱变模式中各阶段的贡献率分析 . 49 断性复 合诱变模式的综合评价 . 50 3 结论与讨 论 . 51 第四章 结论与讨论 . 全文结论 . 51 因子诱 变效应 . 51 因子复 合诱变效应 . 51 性突变 株的筛选结果与应用前景分析 . 52 2 问题与讨 论 . 52 变株抗 药性评价方法与标准 . 52 变对靶 标外其他性状的影响 . 53 变株筛 选方法的改进 . 53 3 本文创新 点 . 53 参考文献 . 谢 .者简历 . 第一章 绪论 第一章 绪 论 1 有益微生物诱变育种技术研究进展 自然中 微生 物常以 一定 频率发 生突 变，但 其突 变的随 机性 大、效 率低 ，很难 满足 现代各 种 育种 目 的 的 需 求 。 现 代 科 学 技 术 的 发 展 ， 通 过 人 工 诱 变 、 定 向 筛 选 或 基 因 工 程 方 法 ， 可 以 定向改良微 生 物 的 特 性 和 性 状 ， 可 在 很 大 程 度 上 满 足 特 定 的 育 种 需 求 。 目 前 微 生 物 诱 变 育 种 方 法 很多，常用的有物理诱变、化学诱变、生物诱变等。 外线诱变 外诱变机理 物理诱 变剂 对微生 物的 诱变作 用主 要是高 能辐 射导致 生物 系统损 伤， 继而发 生遗 传变异 的 一系列复杂的连锁反应过程， 其作用过程通常为物理、 物理 化学和生物学等几个阶段。 常用的物理诱变剂有紫外线、 如 、 等离子、 快 中子、 超声波和激光等。紫外线诱变使用广泛、 效果明显， 诱变频率高， 突变不易恢复， 是微生物育种中最常用诱变手段。 紫外线 是一 种非电 离辐 射，可 以使 物质中 电子 发生跃 迁， 从而引 起分 子激发 而造 成突变 。 由于紫外光谱与核酸的吸收光谱 （ 260一致， 量吸 收紫外线， 因此它极容易受紫外线的影响而引起各种损伤，如 断 裂、 蛋白质交联、胞嘧啶与尿嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚体。紫外突变的主要原因是 内或链间的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚体，由于二聚体的 交 联 作 用 ， 阻 碍 双 链 的 分 开 ， 碱 基 不 能 正 常 配 对 ， 复 制 到 此 处 就 无 法 正 常 进 行 下 去 ， 可能停止进行，或者超越这一点继续复制，造成 常状态，从而引起突变。 另外， 生物 对紫外 线照 射细胞 引起 遗传物 质的 损伤， 自身 具有修 复损 伤的能 力， 其对突 变 体的形成有很大的作用。 在胸腺嘧啶二聚体的修复系统中， 常见的有光修复、 切补修复、 重组修复 、复和 聚合酶校正作用， 其中 复可导致突变的形成 （施巧琴 吴松刚， 2003； 韩业军，2004） 。 外诱变的效果及其应用 低剂量长时 间组合诱变 具有较好的 效果。 各种微生物对于 紫外线的敏 感程度不一 样，对诱变所 需 要 的 剂 量 不 同 。 在 紫 外 灯 的 功 率 、 照 射 距 离 已 定 的 情 况 下 ， 决 定 照 射 剂 量 的 有 照 射 时间，根据 不 同 时 间 照 射 的 死 亡 率 ， 这 样 就 可 以 选 择 适 当 的 照 射 剂 量 。 如 紫 外 线 照 射 豇 豆根瘤菌512(育出的突变菌株合成 力比原 出发菌株高一倍左右，其合成 照射次数有关 （秦家顺 等， 1998） 。 一 般 以照射后微生物的致死率在 90的剂量为最佳照射剂量，也有报道采用致死率 7075%甚至 更低 (3070%)的剂量。偏低的剂量处1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 理 后 正 突 变 率 较 高 ， 而 用 较 高 的 剂 量 时 则 负 突 变 率 较 高 ， 高 剂 量 造 成 损 伤 大 、 恢 复 少 ， 如嗜线虫致病杆菌菌株在低剂量紫外诱变处理下，可获得较高的正突变率（袁京京 等， 2004） 。 紫外诱变的 专一性较低 ，可对靶标 外的性状产 生影响。 如 紫外处理豇豆根瘤菌后，除了突变株合成 能力提高， 同时， 该 突变菌株的耐碱和耐盐能力有明显提高； 紫外线诱变处理绿色木霉 到的快速生长型突变株 以及耐多菌灵突变株 但是， 突变株对棉枯萎病菌、棉黄萎病菌、棉立枯病菌的平板拮抗能力一般低于野生型菌株（秦家顺 等 1998，杨合同 等 2004） 。可见 ，紫外诱变不具有专一性，它往往引起多位点突变。 外界因素 对 紫外突变 的 影响。 2004 年， 吴雪昌指出菌株培养温度对紫外突变率有影响。 他利用紫外线处理产抗生素的链霉菌 (株的分 生孢子，结果表明，在 33下生长获得的子代菌株中， 产抗生素水平超过其出发菌株的正向突变体所占的比例， 明显比在 27下培养的高。 27下培养， 正向突变体占总子代菌株数的 而 在 33下培养则为 用 17种随机引物对出发菌株与紫外诱变子代菌株进行总 验证明，在接近抑制生长的温度 33下 培养获得的子代， 发生在其 平 上的变异程度比在 27的要高得多 （吴雪昌 等2004） 。 这 一 方法能较大幅度提高链霉菌紫外诱变育种的工作效率， 同时也为链霉菌经紫外诱变后突变形成机制的进一步研究提供了新途径。另外，光照影响紫外诱变效率。紫外线使 内或链间的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚体， 在可见光下， 二聚体重新分解为单体， 复成正常的构型，突变率下降。因此，紫外线诱变时，照射或分离均应在红光下进行。 紫外诱变 效 果比较稳 定 。 马燕以芽孢杆菌 出发菌 株， 突变株 量是出发菌株的 314 倍， 且 以较高含量持续到发酵结束 续传代 6 次，遗传性状比较稳定（马燕 等 2004） 。秦家顺等紫外线照射豇豆根瘤菌 512(育出的突变菌株合成 力比原出发菌株高一倍左右 （秦家顺 等， 1998） ； 紫 外 诱变获得了抗真菌活性稳定高于亲本的突变株 和 等 1998） ； 紫外线 诱变处理纳他霉素生产菌 褐黄孢链霉菌 (孢子 ， 可获得了产 抗生素能力为出发菌株 146 倍的突变株 东靖 等 2003） ； 利用抗性筛选与传统的紫外诱变相结合获得高产菌株（ 003） ；紫外 线诱变处理绿色木霉 得到快速生长型突变株 及耐多菌灵的突变株 合同 等， 2004） 。 学诱变 化学诱变剂是一类能改变 构、引起遗传变异的化学物质。各种诱变剂的作用机制都是与碱基直接起化学反应，通过 复制 使碱基发生改变而起到诱变作用的，诱变效应和它们 的 理 化 特 性 有 很 大 关 系 ， 使 用 前 必 须 认 真 了 解 和 掌 握 。 值 得 一 提 的 是 ， 绝 大 多 数 化 学 诱变剂都具毒性，应注意实验者自身安全，防止污染环境。 学诱变的特点 化学诱变 剂 导致的突 变 大多为基 因 突变， 并 且 主要是碱 基 的改变， 尤 以转换为 多 数 。 典型的化学诱变剂 ，如： N其诱发 的基因突变 可发生在损 伤碱基以外的正常序列中 (非定标性突变 )，并有突变谱特征和突变好发的序列特异性（余应年 杨军 2003） 。 2中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 化学 诱变专一性 高，其对基 因的某部位 发生作用， 而对其它部 位影响很小 。 如用 亚硝基胍（ 变稗草生防 菌 禾长 蠕孢稗草专 化型（ ，获得诱变 菌株 其孢子产量 比原始菌株提高 但高产孢突变菌株对稗草的致病性、防效与原始菌株相当（许世文 等 2004） 。 化学诱变 剂 种类很多 ， 从简单的 无 机化合物 到 复杂的有 机 化合物都 能 引起诱变 效 应 ， 它 们对作用机制不同 。 碱基类似物是一类和天然的嘧啶嘌呤等四种碱基分子结构相似的物质， 通过代谢作用渗入到 子中而引起变异。 例如 5 （ 5、 5 5 是胸腺嘧啶的 结构类似物 ； 2嘌呤 （ 、 66分子 结构与腺嘌 呤类似。这一 类 诱 变 剂 要 求 微 生 物 细 胞 必 须 出 在 代 谢 的 旺 盛 期 ， 才 能 获 得 最 佳 的 诱 变 效 果 。 碱 基 类 似物虽具有 很 高 的 特 异 性 ， 因 其 回 复 突 变 率 高 ， 诱 变 效 果 不 大 ， 实 际 诱 变 工 作 中 很 少 使 用 。 烷 化 剂具有多个活性烷基，它们常取代 子 中活泼的氢原子，与一个或多个碱基起烷化反应，引起 对的错误 ，从而发生 突变。常见 的有硫酸二 乙酯（ 、甲基磺酸 乙酯（ 、N ( 、 亚 硝 基甲基尿等。 烷化剂应用的范围较广， 造成的遗传损伤较多。脱氨剂可直接作用于正在复制或未复制的 子， 脱去碱基中的氨基变为酮基，改变碱基氢键的电位，引起转换