【毕业学位论文】三个畜禽品种成纤维细胞库构建及其生物学特性研究硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 三个畜禽品种成纤维细胞库构建 及其生物学特性研究 on 士研究生：李 晗 指 导 教 师：关伟军教授 申请学位类别：农学硕士 专 业：动物 遗传育种与繁殖 研 究 方 向 ：动物细胞与分子生物学 培 养 单 位：研究生院 畜牧研究所 提交日期 2006 年 4 月 on s. 2006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 两个畜禽品种成纤维细胞库构 建及其生物学特性研究 论文作者 李 晗 指导教师 关伟军 培养单位中国农业科学院畜牧研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 冯书堂 研究员 博士生导师 中国农业科学院畜牧研究所 基因与细胞工程 裴丽君 副教授 硕士生导师 北大医学部 流行病学 评 阅 人 答辩 主席 徐玖瑾 研究员 博士生导师 中科院遗传所 细胞生物学徐玖瑾 研究员 博士生导师 中科院遗传所 细胞生物学马月辉 研究员 博士生导师 中国农业科学院畜牧研究所 动物遗传育种与繁殖 文 杰 研究员 博士生导师 中国农业科学院畜牧研究所 动物营养与饲料科学 王立贤 研究员 博士生导师 中国农业科学院畜牧研究所 动物遗传育种与繁殖 裴丽君 副教授 硕士生导师 北大医学部 流行病学 答 辩 委 员 答辩时间、地点 2006 年 6 月 16 日于中国农业科学院畜牧研究所 记 录 吴宏梅 博士 中国农业科学院畜牧研究所 摘 要 采用组织块贴壁培养法，成功地构建了安格斯牛肾组织、丝羽乌骨鸡和白耳鸡鸡胚等三个畜禽品种成纤维细胞库。样本含量分别为 20、59 和 57；细胞传代次数为 3 代；冻存管数分别为 59支、157 支和 322 支；每支冻存管中的细胞数量分别为 06个细胞/07个细胞/07个细胞/据上述三个畜禽品种的成纤维细胞库进行了生物学性状研究、鉴定和综合评价，所得结果如下： 形或不规则三角形；生长时的细胞呈放射状、火焰状或旋涡状走形。镜下观察，细胞生长健康，形态良好。 生长曲线均呈“S”型，细胞经历了潜伏期、指数生长期和停滞期，符合细胞生长规律。冻存前存活率分别为 96；复苏后存活率分别为 复苏后细胞存活率有所下降，其主要原因是细胞在冷冻和复苏过程中遭受机械和化学作用所致。 菌和支原体等微生物检测结果均呈阴性。 n=60，78和78，均保持二倍体性状，遗传性能稳定，可以作为物种鉴别的依据。 工酶酶谱， 条，4 条和 4 条；工酶分别为 5 条，2条和 2 条。两种同工酶酶谱均具种属特异性，细胞遗传性能稳定，表明未发生物种间细胞的交叉污染和恶性转化，可作为物种与品种分类的主要依据之一。 20。对比试验表明：和质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。 学促融的方法，使畜禽品种间两两细胞融合。安格斯牛和丝羽乌骨鸡的细胞融合率为 安格斯牛自身细胞融合率为 丝羽乌骨鸡自身细胞融合率为 并从各个角度充分说明细胞发生融合。细胞融合技术在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。 亡率分别为 检测结果显示，构建的细胞库中的凋亡细胞数量很少，说明所构建细胞库中保存的细胞达到优质细胞标准。本试验是所建细胞库生物学特性研究的延续，为以后的深入研究提供了技术支撑。 本试验所构建的安格斯牛、丝羽乌骨鸡和白耳鸡三个畜禽品种的成纤维细胞库均达到 辟了畜禽遗传资源在细胞水平上的长久保存的新途径，同时也为生命科学和动物克隆等研究提供宝贵材料。 关键词 成纤维细胞库 基因表达 细胞凋亡 细胞融合 I to we in of 0, 59 7; of 9, 157 22 0607ml 07we of of 1. or it or 2. it s S. 6%; to is in in to is 3. We on 4. n=60, 78, 78. of So it be to 5. To of DH to be is 6. in of 20. 7. EG to by , . It up a s 8. By to it in to is of in of EG 目 录 英文缩略表 . 6 第一章 绪论 . 1 胞培养技术发展概述 .物细胞的培养方法 . 贴壁培养法 . 悬浮培养 . 固定化培养 .物细胞的应用 . 生物学基础研究中的应用 . 动物细胞产品的开发和应用 . 临床医学方面的应用 . 育种方面的应用 .构建细胞库的生物学研究 . 细胞形态学及活力检测 . 细胞的微生物检测 . 细胞遗传学特征 . 基因转导 . 细胞融合分析 . 细胞凋亡分析 .二章 细胞库构建及检测 . 11 验材料 . 11 试验动物 . 11 主要仪器设备 . 主要试剂 . 成纤维细胞培养试剂 . 微生物检测试剂 . 染色体标本制备所用试剂 . 脂质体转染细胞所用试剂 . 同工酶分析所用试剂 . 细胞融合所用试剂 .0 细胞凋亡检测所用试剂 .验方法 . 15 细胞培养 . 细胞库质量检测 .三章 细胞库生物学特性研究结果 . 21 胞形态特征 . 21 原代细胞的生长情况 . 传代细胞的生长情况 .胞的冻存与复苏 . 24 胞生物学检测 . 26 细胞活力检测 . 微生物检测 . 遗传学检测 . 脂质体介导外源基因在细胞中的表达 . 细胞融合分析 . 细胞凋亡分析 .四章 全文结论 . 47 参考文献 . 49 致 谢 . 53 作 者 简 历 . 54 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 鼠肾细胞 ,6 2 氨基苯基吲哚 s s 限量 养基 甲基亚砜 化乙啶 二胺四乙酸 组人促红细胞生长素 牛血清 蹄疫 6 萄糖6 磷酸脱氢酶 体内生长荷尔蒙 酸脱氢酶 果酸脱氢酶 良 养基基乙二醛 甲基偶氮唑盐比色法 化型辅酶 牛血清 苷磷酸化酶 t PA 织型纤溶酶原激活剂 酸缓冲液 增时间 乙二醇 物血球凝集素 化丙啶 嗪硫酸甲酯 甲基乙二胺 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪论 当今世界正进入地球史上生物灭绝的又一个速率最高时期，平均每年有数以千计的物种消失。畜禽遗传资源是生物多样性的重要组成部分，是人类社会赖以生存、可持续发展和科技创新的重要物质基础，并且关系到国家的安全与主权，决定了国家的兴衰，从而引起国际社会的普遍关注。 20 多年来，由于国外优良畜禽品种的大量引进、集约化选育和生产等诸多因素的影响，导致我国很多地方畜禽品种处于灭绝、濒临灭绝状态，如不及时采取有效措施进行抢救性保护，后果不堪设想。 尽量全面、妥善地保护现有畜禽品种的种质资源，其实质就是使现有的基因库中的基因资源尽量全面保存。根据动物遗传资源多样性在不同层次的特点，可以采取不同的保种措施和方法。在品种水平上的基本保存方法是原位保存，而随着分子生物学技术的进步，各种冷冻细胞、冷冻胚胎以及 库等易位保存方法也被广泛地应用到动物遗传资源保存中。目前在世界范围内成功建立的各种冷冻细胞系、株不胜枚举。 从本质上讲，细胞生物学是生命科学研究的基础。如果离开了细胞生物学作为支撑，生命科学的研究将寸步难行。那么，一个或多个品种的灭绝意味着细胞生物学和分子生物学对它或它们进行研究的基本研究材料的永远丧失，如果这些品种在灭绝前未曾以任何方式将它们的种质资源保存下来，不仅永远丧失了其基因资源，而且使科学家们对于它们诸多未知的细胞生物学和分子生物学的机理的探索及通过体细胞克隆技术使之再现的愿望将永远成为谜和梦，同时也将是世界遗传资源遗产和生命科学理论宝库的巨大损失 1。因此，在全球性的抢夺生物资源和保护生物多样性的严峻形势下，根据我国资源保存的实际出发，通过构建重要畜禽品种的遗传资源群体细胞库和生物学特性研究，不仅在细胞水平上长久的保存重要畜禽品种的遗传资源，为畜禽品种基因组和后基因组及体细胞克隆等研究提供宝贵试验材料，同时更重要的是为我国畜禽遗传资源细胞库构建和生物学特性研究搭建了技术平台，为全国畜禽遗传资源细胞水平的保存和研究提供技术与理论支撑和保障。 胞培养技术发展概述 细胞培养技术始于 19 世纪末，由胚胎学技术衍生而来 2，是指人工条件下离体的动物活细胞体外生长、增殖，而不再形成组织的过程。在近一个世纪的发展中，细胞培养技术已从精细实验室、对少数组织的小规模培养模式中走出，向着大型化、自动化、精细化的方向发展。随着生物技术的发展，细胞培养技术已成为生物制品制备以及基因工程等领域必不可少的工具之一。 动物细胞培养技术的发展概要为 3： 1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1907年 立体外组织培养法。 1951年 开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。 1957 年2）107个细胞/志着现代灌注概念的诞生。 1962年 功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞系 标志着动物细胞大规模培养技术的起步。 1967年 50 为载体培养动物细胞获得成功。 1975 年 在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株 无血清介质中生长获得成功，预示着无血清培养技术的诱人前景。 1975 年 功地融合了小鼠 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 1986年io 1989 年 次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制，更新了传统细胞培养工艺中优化控制之理论。 1997 年，4利用成年哺乳动物的体细胞与去核的卵母细胞融合并发育出了克隆个体，证实体细胞通过基因组重编程，又能恢复其发育全能性 5。 物细胞的培养方法 动物细胞的培养大致有贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等方式 6，根据所需培养细胞的生长特性、实验目的和实验条件而选用不同的培养方法。培养细胞的组织来源十分广泛，但某些组织细胞在体外培养时更易于生存、生长。通常情况下，肿瘤细胞易于正常细胞，胚胎细胞易于成体细胞，结缔组织细胞易于上皮组织细胞 7。 贴壁培养法 大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上，才能正常生长并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下，采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。 悬浮培养 少数动物细胞属于悬浮生长型，这些细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长，如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时2中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快，产量高，培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。 固定化培养 动物细胞固定化培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上，融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。始于20 世纪 60 年代初生产8。其后，随着生物技术产品倍受世人青睐，动物细胞大规模培养技术也随之得到了迅猛发展，并形成了几种比较成熟且有应用价值的大规模培养方法。 空心纤维法：空心纤维培养法是972 年创建的 9。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为 1/33/4面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。这种培养系统的核心部分是由 36层这样的空心纤维组成的， 培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到 107108个/渐用无血清培养液代替含血清培养液。此时细胞虽不再增殖，但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。并相继开发出了由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的新的空心纤维培养系统。 微载体法：微载体法是10。所采用的微载体是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠，其直径约在 50养动物细胞时，先将微载体在血清中浸泡一下(可加快细胞与微载体的贴附速度)，然后将制备好的细胞悬液和微载体混合孵育一段时间，待细胞贴附于微载体上后，再转移至培养液中培养，并借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。这样细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖，细胞浓度可高达 107个/11。微载体法是一种完全将贴壁培养和悬浮培养融为一体的培养方法。因而不但能使细胞均匀分布，提高了对培养液和培养空间的利用，而且适于各种细胞的大规模培养，收获过程简单，放大生产也很容易。因而是一种比较理想的大规模培养方法。只是此法对微载体的要求较高。 微囊法：微囊法是美国12。其基本技术是：先将欲培养的动物细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，之后使其通过一种成滴装置(微囊发生器)而逐滴滴入溶液中，海藻酸钠一旦进入溶液后即形成半透膜微囊，从而将细胞封闭在其内。然后再将这种包含有细胞的微囊悬浮于培养液中培养。这样培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞，细胞的代谢物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累与囊内。当培养一段时间后，在细胞密度达到107个/后破开微囊就能获得高度纯化的大分子产物。 3中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 物细胞的应用 目前在世界范围内成功建立的各种细胞库不胜枚举，其应用范围广泛，不仅可以弥补活体保存、精液和胚胎冷冻保存技术的不足，成为代替原位保护的好方法，而且也为克隆技术实际保护效益的评价提供了充足的源泉，对各种生物学研究有巨大用途，进而对自然世界和自然进化有更深入的理解。 生物学基础研究中的应用 离体培养的动物细胞其培养条件可人为控制且便于观察检测，因而可广泛应用于生物学领域的基础研究中。在细胞生物学上，动物细胞培养可用于研究动物的正常或病理细胞的形态、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。如神经细胞的增殖、突起生长、相互识别、刺激传递等机理就是通过进行各种神经细胞的培养才弄清楚的；在遗传学研究中，可用培养的动物细胞进行核型分析，还可结合细胞融合技术建立细胞遗传学，进行遗传分析和杂交育种；在胚胎工程中，可将体外培养卵母细胞、体外受精、胚胎分割和移植应用于家畜的繁殖生产中。另外，分离和培养具有多潜能性的胚胎干细胞，可应用于动物克隆、细胞诱导分化、动物育种的研究，还可作为基因转移的高效表达载体；在病毒学研究中，用培养的动物细胞代替试验动物做斑点分析，不仅方法简便、准确，而且重复性好。 动物细胞产品的开发和应用 动物细胞的体外培养物能产生许多有价值的生物制品，包括重要的疫苗、高效的治疗药物和灵敏的检测、诊断试剂。如用 胞高密度培养工业化生产疫苗以及 K、昆虫细胞杆状病毒表达系统生产安全可靠的生物杀虫剂；用鸡胚细胞生产鸡法氏囊、新城疫、马立克等多种疫苗；用转基因技术克隆 因，并在 产重组人促红细胞生成素等。 临床医学方面的应用 首先，动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。如人们用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞，经培养后进行核型分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型，以此可避免先天残疾儿的诞生。并且用此方法可检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，从细胞分子水平揭示一些疾病的病理、病因，并为早期诊断和预防提供了科学依据。另外，动物细胞培养生产的生物大分子制品可用于治疗某些代谢缺陷疾病，如利用动物细胞培养生产的重组人促红细胞生成素在临床上用于治疗肾衰性贫血、癌症患者化疗后贫血，以及择期手术者的自身输血血液储备都有极显著的效果。 4中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 育种方面的应用 通过细胞培养技术、细胞融合技术、细胞杂交技术以及转基因技术的相互结合，使得人们能够在细胞水平操作并改变动物的基因，进行遗传物质的重组。这样就可以按照人类的需要大幅度地改变生物的遗传组成，从而使新品种的培育在实验室中即可完成，大大缩短育种进程。胚胎干细胞的研究成果和克隆羊多莉的问世可以说已为动物遗传育种开辟了一条新途径。 构建细胞库的生物学研究 除了要对细胞培养的条件和方法，培养细胞的物种、性别、年龄及取材器官或组织，所使用的培养基、冻存液、血清来源、使用浓度，及温度、浓度和要对收集和冻存的成纤维细胞进行以下几方面内容的生物学特性研究： （1）细胞形态学及活力检测，即细胞的一般形态、特征性结构，以及生长曲线和倍增时间等细胞活力的检测； （3）微生物检测，针对细菌、真菌及支原体等的污染检验； （2）遗传学检测，通过核型分析鉴定染色体畸变率及培养细胞的种间交叉污染；同工酶分析，检测细胞系（株）间是否发生交叉污染，主要为 （4）基因转导，应用脂质体介导法转染荧光报告质粒来研究成纤维细胞转化表达外源基因的特性。 （5）细胞融合分析，在诱导剂 个或两个以上细胞或原生质体不经过有性生殖而融合形成杂种细胞的过程，从而打破依赖有性杂交重组基因创造新生物的界限和生殖壁垒，扩大遗传物质的重组范围。 （6）细胞凋亡分析，利用 特异性荧光染料 非嵌入式与 合，根据细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞的凋亡情况。 细胞形态学及活力检测 细胞形态 体外培养的细胞，其形态结构与体内的基本相似，胞体表型上发生去分化变化，但形态