【毕业学位论文】猪源 H5N1 亚型流感病毒的分离鉴定及其反向遗传系统的搭建博士论文

密级：机密20年 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 猪源 型流感病毒的分离鉴定及其 反向遗传系统的搭建 5N1 of 士研究生： 张 强 童光志 研究员 指导教师： 仇华吉 研究员 申请学位类别： 农学博士 专 业： 预防兽医学 研究方向： 动物病毒分子生物学及基因工程 研究生院 培养单位： 哈尔滨兽医研究所 2007年6 月 20 5N1 of 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 中国大陆 1996 年首次在广东省分离到 型高致病力禽流感病毒， 1997 年香港发生了型禽流感病毒直接感染人，致 18 人感染 6 人死亡事件， 2003 年新的病毒又杀死了两个感染者中的一个。从此人们对 型禽流感的关注超乎寻常， 流感已经不是动物的传染病，而是一种致命的人畜共患传染病。 2004 年以来， 型禽流感病毒几乎传遍了亚洲，传向了欧洲，传入了非洲，引起大量的禽类死亡，人类死亡数目也不断上升，造成了严重的经济损失和社会影响。 至发出了全球 感大流行的警报。猪作为人流感病毒和禽流感病毒的混合器，在流感病毒的变异重组上扮演重要角色。近几年在国内猪群内分离到了 型流感病毒，引发了国际社会的广泛关注。猪源 型流感病毒的致病性到底如何，来源何处，是否在猪体内发生了重组，一直是人们普遍关注的问题。 本研究首先对 20012005 年间在我国的福建省、 黑龙江省及广东省分离到的 10 株猪源 果表明，所有 10 株猪流感病毒对 具有高致病性，静脉接种指数在 间；经鼻腔滴鼻感染 106毒很快侵入全身器官，引发系统性致死性感染，主要表现为急性肺水肿、肺出血和充血，脑水肿和坏死，肾、心肌、胰腺淤血以及肝脏淋巴细胞增生等 病理学变化，与高致病性禽流感病毒一致。 为了进一步了解我国 流感分离株对哺乳动物的致病能力及其在哺乳动物群体中的传播能力，我们将 10 株流感病毒以 1068 周龄 c 小鼠，同时混养同等数量的未感染小鼠做为水平传播模型，每隔 4d 对所有小鼠称重，同时剖杀 2 只接触感染鼠病毒分离。试验结果显示，这 10 株病毒中的 j/1、 j/1、 、 、d/5 和 d/5 等 6 个毒株对小鼠有不同程度的致死能力，而广东的两个毒株d/5 和 d/5 在 10d 内致死所有感染小鼠。接触感染试验显示除 、d/5 和 d/5 毒株组外，其他毒株组的接触感染小鼠内脏都可以分离到病毒，但16d 后则所有分组都分离不到病毒，说明部分毒株初步具备了水平传播的能力，但少量病毒在小鼠体内复制能力有限，不具有致病性。 对 10 个毒株进行了全基因组序列测定，完成了序列的同源性分析和系统进化分析，其结果表明所有毒株的基因片段都与国内近几年流行的禽流感病毒高度同源， 因裂解位点均表现为连续的多个碱性氨基酸的高致病力毒株特征，部分毒株 部有 20 个氨基酸缺失，所有毒株 因都有 5 个氨基酸缺失，这些基因组的特征与对小鼠的致死性之间没有明确的相关性。福建毒株（包括 取序列）之间虽然年份不同，地点不同，但各个片段高度同源性，具体原因不明。目前还没有发现猪源 型流感病毒已与其他病毒在猪体内发生了重组。 在对病毒生物学特性明确，全基因组序列清楚的基础上，我们搭建了我国最早的猪源 w/P/01 的反向遗传平台，为下一步研究猪源 型流感病毒的分子致病机理，开发猪流感的基因工程疫苗打下基础。 关键词：猪流感， 型流感病毒，哺乳动物，系统进化，反向遗传 he 5N1 of 997 5N1 to 8 003, a 5N1 of to 5N1 of 5N1 of is a a 004, to of 5N1 of of is 5N1 is a to HO a 5N1 of an on of In It 5N1 on of 5N1 In we of 0 5N1 001 of 0 PF .9 .0 HO 06 of in in of in in To of in in - c n=8) 060 l by In in w/P/01、 j/1、 、 、 d/5、 d/5 a to to w/T/05 w/6/05 0 be of w/、 d/5 w/9/05 t 6 of 5N1 to of of 0 5N1 of of in 0 a of at A is a of 0 A S ,no to in 9% t no 5N1 in On of of we a j/1,5N1 in in 5N1 文摘要 . I . 格清单 . 图清单 . 汉缩略词 .一章 引 言 1 1 猪流感的研究进展 . 1 1 1 1 猪流感及猪流感病毒 . 1 1 1 2 猪流感的早期历史 . 1 1 1 3 猪流感的流行病学 . 2 1 1 4 流感病毒在猪和其他物种之间的传播 . 5 1 1 5 流感病毒对宿主的适应 . 7 1 1 6 猪在流感病毒基因重组过程中的作用 . 7 1 1 7 猪流感的公共卫生意义 . 8 1 2 A 型流感病毒反向遗传学研究进展 . 9 1 2 1 流感病毒的复制 . 10 1 2 2 功能性 合体的重建 . 10 1 2 3 研究流感病毒复制和转录的系统 . 10 1 2 4 基于辅助病毒产生流感病毒 . 11 1 2 5 可突变任意流感病毒基因片段的拯救系统 . 12 1 2 6 完全基于 粒拯救流感病毒系统 . 12 1 2 7 流感病毒反向遗传系统的新发展 . 14 1 2 8 流感病毒反向遗传系统的应用展望 . 15 1 3 本研究的目的和意义 .二章 猪源 型流感病毒分离及其生物学特性研究 2 1 材料与方法 . 17 2 1 1 细胞 . 17 2 1 2 实验动物 . 17 2 1 3 试剂 . 17 2 1 4 病料采集和处理 . 17 2 1 5 病毒分离 . 17 2 1 6 病毒纯化 . 18 1 7 亚型鉴定 . 18 2 1 8 病毒感染力的滴定 . 20 2 1 9 对鸡的致病性试验 . 21 2 1 10 c 小鼠的鼻腔感染试验 . 21 2 2 结果 . 22 2 2 1 病毒分离结果 . 22 2 2 2 流感病毒亚型鉴定结果 . 22 2 2 3 半数组织感染量（ . 23 2 2 4 鸡致病性试验 . 23 2 2 5 小鼠致病性试验 . 28 2 3 讨论 . 30 2 3 1 型流感病毒在猪体内的出现 . 30 2 3 2 猪源 型流感病毒对禽是高致病力流感病毒 . 31 2 3 3 猪源 型流感病毒可致死哺乳动物并初步具备水平传播能力 . 31 第三章 猪源 型流感病毒的分子进化研究 3 1 材料与方法 . 32 3 1 1 毒株 . 32 3 1 2 菌株 . 32 3 1 3 试剂与仪器 . 32 3 1 4 引物 . 32 3 1 5 提取与反转录 . 33 3 1 6 目的片段的回收 . 33 3 1 7 目的片段的克隆 . 34 3 1 8 序列测定 . 35 3 1 9 序列拼接与分析 . 35 3 2 结果 . 37 3 2 1 序列测定结果 . 37 3 2 2 析结果 . 37 3 2 3 因分析 . 37 3 2 4 因分析 . 42 3 2 5 因分析 . 47 3 2 6 因分析 . 49 3 2 7 因分析 . 51 3 2 8 因分析 . 53 3 2 9 M 基因分析 . 55 3 2 10 因分析 . 57 3 3 讨论 . 59 3 1 因及其编码的氨基酸 . 59 3 3 2 因及其编码的氨基酸 . 59 3 3 3 其他内部基因 . 60 3 3 4 猪源 型流感病毒的来源 . 61 第四章 猪源 型流感病毒 A/P/01 株反向遗传平台搭建 4 1 材料与方法 . 63 4 1 1 毒株 . 63 4 1 2 细胞 . 63 4 1 3 载体 . 63 4 1 4 主要试剂 . 64 4 1 5 引物 . 64 4 1 6 取和反转录 . 65 4 1 7 8 质粒系统的构建 . 66 4 1 8 间接免疫荧光检测基因的表达 . 66 4 1 9 病毒的拯救 . 67 4 2 结果 . 67 4 2 1 酶切鉴定 8 质粒系统 . 67 4 2 2 定 8 质粒系统 . 68 4 2 3 间接免疫荧光检测蛋白的表达 . 69 4 3 讨论 . 69 结论 . 72 参考文献 . 73 附录 . 88 附录 1 10 株猪源 型流感病毒的全基因组序列 . 88 附录 2 10 株猪源 型流感病毒基因片段 析结果 . 110 附录 3 体工作原理 . 114 附录 4 合酶 I/统工作原理 . 115 致谢 . 116 作者简介 .表 2流感病毒的亚型鉴定 . 22 表 210 株猪源流感病毒 . 2猪源 型流感病毒对鸡的静脉接种指数 . 2试验感染鸡体内病毒的分离结果 . 2小鼠感染试验结果 . 3型流感病毒全基因组扩增引物 . 3型流感病毒基因片段扩增条件 . 3取参考毒株 . 36 表 310