【毕业学位论文】枯草芽孢杆菌TU100 的发酵条件以及抗菌物质的研究硕士论文

密级： 论文编号：中国农业科学院硕士学位论文枯草芽孢杆菌瑞指导教师：江木兰申请学位类别：理学硕士专 业：微生物学研究方向：植物与微生物的互作关系培养单位：研究生院油料作物研究所提交日期206年6月我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月 日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)论文作者签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日论文评阅人、答辩委员名单论文题目 枯草芽孢杆菌位 专业评阅人邓西平研究员博导中国科学院西北水保所 作物生态方小平副研究员硕导中国农业科学院油料作物研究所植物病理答辩主席李云昌研究员 博导中国农业科学院油料作物研究所作物遗传育种答辩委员杨国正副教授 硕导 华中农业大学作物栽培蔡得田教授 硕导 湖北大学 作物遗传育种刘贵华研究员 博导中国农业科学院油料作物研究所作物遗传育种方小平副研究员 硕导中国农业科学院油料作物研究所植物病理答辩时间、地点2006年6月18日于中国农科院油料作物研究所加工中心会议室记录枯草芽孢杆菌（油菜根圈能够有效定殖、促进油菜生长和防治油菜菌核病。本文以其进行了产抗菌物质的发酵条件研究，并从其发酵液中分离纯化出能抑制多种植物病原真菌的小分子类似抗菌肽物质。采用不同的培养温度、不同的培养时间、不同的培养基养基C/其发酵液的抗菌物质产量和抗菌活性进行了检测；得到了，通气良好的150这个条件下培养48h，细菌数达到最大值，培养72h，抗菌物质产量达到最大值。枯草芽孢杆菌放到培养液中，具有耐121高温、耐有多种抗逆作用性质。抗菌物质可以溶解于甲醇、乙醇等有机溶剂中，通过调节机溶剂抽提、分离纯化抗菌物质，最后通过葡聚糖凝胶层析可以得到较纯的抗菌肽。丝膨大、断裂，最后崩解。在油菜、大豆和玉米离体叶片防治试验中，表现出具有较高的抑制活性。枯草芽孢杆菌抗菌物质的提取液稀释100倍后仍然能保持显著的拮抗效果。能诱导油菜体内相应防御酶活性的升高，从而产生植株抗性。关键词：枯草芽孢杆菌，抗菌物质，培养条件，生物防治. 8h, 0. l.&u、O、.目前生防细菌应用的主要种类.芽孢杆菌研究概况.究现状.生防细菌产生拮抗物质的种类.类物质.抗菌物质的病害防治应用研究.抗生作用.营养竞争作用.溶菌作用.促进植物生长、增强植物抗性.诱导系统抗性（.农业应用.药.医药卫生.义及研究内容.实验材料.提物抗菌活性的检测.枯草芽孢杆菌.长培养基最佳.比的筛选.枯草芽孢杆.度.比.实验材料.抗菌物质的提取纯化.发酵液制备.有机溶剂抽提.抗菌物质的理化性质.定性研究.抗菌物质的分离纯化.抗菌物质理化性质研究.三酮.抗菌物质的抗菌效价. 实验材料.株.抗菌物质的抗菌谱实验.豆菌的离体叶片实验.春红等，205).内.内.抗菌物质的抗菌谱实验.验.此病害防治成为当务之急。目前， 的防治方法主要是利用抗病品种和化学防治为主。使用抗病品种可以达到经济有效 效果，但要获得一个理想的抗病品种，并不是一件容易的事情，而且抗病品种往推广几年以后容易丧失性。化学防治在病害防治中起到重要的作用，但它又受到三个因素的限制：一是目前高效低毒的杀菌剂农药品种较少；二是环境条件对防治效果影响很大，在环境条件适宜病原侵入和传播时，防治效果不令人满意；三是容易造成环境污染。作为病害防治方法之一的生物，在某些情况下，具有良好的防治效果，并成为目前研究和开发的热点。近年来国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌的生存和活动，使这一防治策略发展迅速，其中防细菌在植物病害防治中起到非常重要的作用无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物的生物类型中，细菌的作用非常明显。其主要优势在于：1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和寄生、诱导植物产生抗性等方式 产生影响；3)具有惊人的繁殖速度；4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的态比较适宜；5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6)有些细菌不仅能防治病害而且增加作物产量。土壤中存在着各种各样的微生物，其中包括了细菌、真菌、放线菌、原生动物和藻类等。细菌因为繁殖迅速，极强的营养利用能力，种类繁多而最为常见。土壤中的细菌，大多结合在土壤表面或者与土壤形成土壤结合体，并且大多与植物根系有专一性的互作关系。现为植物根系周围的细菌密度远高于土壤中的其他部位。细菌与植物之间的互作用对来讲，可能是有益、有害或性。有时候，有些细菌的效应可能因土壤条件而异。比如，当土壤中含氮量不足时，某一固氮生物可以促进植物生长，但是，当植物得到充足的外源源时，它就不定再对植有作用。根据细菌与植物的结合方式，对植物有益的细菌可以分为三类：共生细菌、附生细菌和根际自生细菌。根瘤细菌就是典型共生细菌，因其一直作为人们研究的重点。植物 对植物的作用比共生细菌更为广泛所以近几十年发展迅速1生防细菌概况生防细菌常位于根系的表面及根围土壤，甚至位于根内。其种群动态与所伴植株的生长状况息相关，它们在长期的自然演变过程中形成了互相依赖、互相促进、互惠互利、密不可分的复杂关系。近年来，国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生防细菌统称为植物促生根圈细菌简称固氮螺旋菌(假单孢杆菌(、醋杆菌属(芽孢杆菌(等。接的促生作用是指整体上讲，产生抗菌物质并不是所有细菌的特征，有些生防菌不仅能防病而且有促进植物生长和增产作用。目前应用较多生防细菌主要有芽孢杆菌(假单胞杆菌(、土壤放射杆(固氮菌属（氏菌属(、沙雷氏菌属（及其它一些细菌。芽孢杆菌是一群好氧或兼性厌氧、产芽孢的G+杆菌的总称，其生理特征丰富多样，分布极其广泛，极易分离培养，是土壤和植物体表、根际的重要微生物种群。芽孢杆菌突出的特征是能产生耐热抗逆的芽孢，这有利于生防菌剂的产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种较理想的生防微生物。目前国内外应用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛如用于防治马铃薯疮痂病（番茄青枯病（苹果红腐病（小麦赤霉病其它一些土传和地上部病害（杨佐忠，201）。目前用于生防细菌的种类有：枯草芽孢杆菌(B多粘芽孢杆菌(蜡状芽孢杆菌(巨大芽孢杆菌(短小芽孢杆菌(（程亮，2003）（表1）。表1具有生防作用的芽孢杆菌种类及特性理特征枯草芽孢杆菌（Bm。生长在葡萄糖洋菜上的细胞原生质均匀染色。芽孢椭圆形或柱形，中到偏中生。即使孢囊膨大也不显著。蜡状芽孢杆菌（m。生长在葡萄糖洋菜上的淡染色具有不着色的小球。芽孢中生到次端。有罕见的膨大孢囊。解淀粉芽孢杆菌（B。生到近中生。芽孢囊不膨大。地衣芽孢杆菌（m。芽孢椭圆形或柱形，中生或偏中生。孢囊不膨大或只是轻微膨大苏云金芽孢杆菌（m。生长在葡萄糖洋菜上的细胞具有不着色的小球。芽孢中生到偏中孢囊膨大不明显。环状芽孢杆菌（m。革兰氏阳性可变为革兰氏阴性。芽孢一般椭圆形，亚极生或极生孢囊膨大。短芽孢杆菌（m。革兰氏阳性可变为革兰氏阴性。芽孢一般椭圆形，中生、近端生或端生。孢囊膨大。胶质芽孢杆菌（兰氏染色阴性，夹膜厚，有时比菌体大10倍以上，或有2小芽孢杆菌（m。生长在葡萄糖洋菜上的细胞染色时里边无不着色的小球。芽孢椭圆形或柱形，中生到偏中生。孢囊不明显膨大。中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述9林福呈等（190）自西瓜根际分离的三个枯草芽孢杆菌株对西瓜枯萎病菌大、小分生孢子的萌发及芽管的生长均有明显的抑制作用；陈志谊等（197）应用大田推广使用，效果显著，显示出其作为生防菌的巨大潜能。此外，王政逸等（190）分离的28菌株对立枯丝核菌(对寄主生长有较好的促进作用；张学君等（194）表明芽孢杆菌对棉花枯萎病菌(立枯病菌(黄萎病菌(炭疽病菌(棉铃疫霉病菌(和棉叶斑病菌均有强烈的抑作用；魏春妹等（200）制得的细菌生防制剂青枯散，而且能促进番茄、花生、黄瓜、烟草、油菜等作物生长；游春平等（201）分离的短小芽孢杆菌(B稻瘟病菌有显著的抑制作用晏立英205从油菜根际和叶围分离到的枯草芽孢杆国外利用由得较好的效果。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌(B防菌株获得环保局(品化或有限商品化生产应用许可，根部施用或拌种可治镰孢菌属（曲霉属（链格孢霉属(丝核菌属(起的豆类麦类、棉花和花生根部病害。此外，澳大利亚开发的3对麦和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有很好的防治和增产作用。日本东京技术研究所的枯草芽胞杆菌菌株尖孢镰刀菌（青枯假单胞菌起的番茄病害有良好的防效（96）。近年来，0世纪70年代，美国的加州大学率先研究了该菌，当时就引起了普遍关注（976）。1978年经证实，在甜菜和萝卜上同样能改善其生长。使马铃薯增产53%。标病菌/病害 机制P抗（4 抗(抗(抗(导抗性争和诱导抗性生/捕食P抗（表面活性剂）中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述10该细菌大量存在于植物的根围和叶围，土壤中是以不同生物型的荧光假单孢菌(主，而在叶表主要以丁香假单孢菌(主，这类细菌以及草生欧氏杆菌(E某些菌株对植物气生部分病害有一定的影响。目前应用的主要种类有荧光假单孢菌(洋葱假单孢菌(恶臭假单孢菌(。国内利用荧光假单孢菌防治多种植物病害，如小麦全蚀病(棉花幼苗猝倒病(马铃薯软腐(。976）产生的抗菌物质种大豆可免遭受P94）发现由假单孢菌子包衣处理可减轻小麦全蚀病的发生。许煜泉等（199）用假单孢菌瓜枯萎病的发病率降低7O8O%。现在已经有较多假单孢菌菌株在生产上得应用，用于防治多种植物病害（表2）。壤放射杆菌(在澳大利亚进行商品化生产，防治由桃、玫瑰等果树根癌病；李金云等（204）分离到的葡萄土壤杆菌年来，放射性土壤农杆菌的研究取得了新进展，进一步证实了和生物分)土壤农杆菌的抑制性，对来自葡萄的生物对核桃根癌病的防效可达10%，并试验地开发出了根癌宁。氏杆菌因其具有抗性内生孢子，易于附着线虫体壁和侵染线虫，寄生后又可产生大量的孢子，再次实现侵染且性能稳定而受到植病学家的青睐成为线虫防治的又一生防菌。此外，还可用内生巴氏杆菌来抑制某些引起冻害的细菌，减轻冻害发（李成云197）。此外，曾有报道具有分泌几丁质能力的节杆菌属（可用来防治由sp漫红，194）。当然，拮抗细菌还有很多。如：治梨火疫病(E张玉勋等(200)研究了P5号菌株和1菌株在大棚温室番茄上定殖及其对灰霉病的控制效果。生抗逆性内生孢子的杆状细菌。由于能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品有很强抗性芽孢,可忍受各种不良环境,可以在低可以在温度高达80的地方生长,南极寒冷的冰雪中也能找到它们的踪迹,在自然界分布极为广泛（975）。芽孢杆菌属与人类关系极为密切,是越来越引起人们重视和研究的一个重要的微生物种群。第一个尝试对好氧有芽孢细菌进行分类的是916）其后，1921年，国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述1把芽孢杆菌属定义为“好氧，产芽孢的杆菌，通常革兰氏染色反应呈阳性”，此标准逐渐被后来者所接受。1938年小、位置作为不同分类单位的指标。芽孢杆菌属的一个重要特征是好氧生长。最早在1907年就有人提出将该特征作为一个分类依据，但相当长时间内仍然有部分检索表未采用“好氧生长”作为分类标准。事实上本标准并非可有可无，因为并不是所有产芽孢的杆状细菌都属于芽孢杆菌属。芽孢的发现和研究历史迄今已有百年，到现在，有关芽孢的生理性质、生化组成以及生孢形态学和遗传学研究经成为一个非常重要的领域，其中枯草芽孢杆菌的研究已经成为原核生物分化的最好范例。芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些多肽还抑制革兰氏阴性、酵母和霉菌。其中一些抗菌肽已被应用于治疗人类、动物和植物的疾病，同时也可作为生物表面活性剂、食物防腐剂、饲料添加剂和分子生学研究工具（表3）。植物病原真菌是引起植物病害，造成农业损失的主要原因之一。枯草芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质，且对人畜无害，不污染环境，因而在生物防治植物病害中起着重要作用。迄今为止，国内外多家实验室通过分离纯化枯草芽孢杆菌的发酵产物，得到了一些高分子量的抗菌物质和小分子量的抗菌肽。最为常见为一些小分子量脂肽类抗菌物质，如表面活性素(芬枯草菌素(伊枯草菌素(。表3在植病生物防治中一些有代表性的生防芽孢杆菌目前对芽孢杆菌的研究仍然是方兴未艾。其中很大一部分工作是集中在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中，或者是通过诱变、基因程等手段对属于芽孢杆菌属的生产菌进行改造（冯清平等，196；王红革，197；陈玮，197）。然而，分子物学手段在芽孢杆菌领域的应用并不意味着可以忽视天然野生菌株资源的探查工作。如果没有优良的出发菌株和多样的原始基因，分子生物学、细胞学等方法、手段就成为无本之木、无源之水。因此，调查特定区域内芽孢杆菌的资源，分离和描述具有不同生理特征的菌株，分离、保藏新的菌种、变种等，可以不断补充现有的微生物资源库。很多研究工作者对不同地区、不同类型性质的土壤进行了芽孢杆菌的调查，并探讨了各种生态因子芽孢杆菌分布的影响（李振高，195；戴顺英，拮抗菌 目标病菌/病害 蓿猝倒病 03 棉花枯萎病；菠菜枯萎病 6 瓜果腐霉 姜青枯病 抗菌物质及位点竞争 大豆根腐病 抗菌肽中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述12196；黄洋等，196）。随着经济的发展，对在工、农、医等方面有重大应用价值的芽孢杆菌资源的开发利用则更具有科学意义。通过对芽孢杆菌属细菌的研究，一方面可以积累其分布规律资料，为正确制订相应的保护措施提供理论依据；另，也可了解芽孢杆菌与生态环境之间的互关系，为芽孢杆菌资源的持续利用奠定基础（李荣森等，190；郝文英等，1983；尹瑞龄等，195）。防细菌在离体条件下产生各种各样的次生代谢产物。早期对究证明，该菌的某些菌株产生嗜铁素(它可以与环境中的铁离子高度结合而使植物病原菌缺乏营养不能够生长繁殖（980）。自从1945年们已从枯草芽孢杆菌的不同菌株中分离出几十种抗菌物质，并弄清了这些抗菌物质是一类从简单分子到复杂化合物即从杆菌肽(王岳，198），大环脂(986；987），到类似噬菌体颗粒（976）等不同成份组成的物质，此外，其中一部分是低分子量的抗菌素，也有一些蛋白性的抗菌物质（983）。目前研究较多的拮抗物质是细菌素和抗生素以及细的其它次生代谢产物。00）；1954年，l有拮抗作用，有些菌株具有产生抑菌物质的能力；后来978）对这种物质进行分析，证明它是含蛋白质的细素(979深入研究细菌素的特性认为前细菌素通常是指由基因编码的初始蛋白质加工而成的多肽类或蛋白类拮抗物质，对产生菌自身具有特异性保护作用（免疫作用）。也有部分为不同蛋白的复合物或蛋白质与碳、氢化合物的复合物等。王金生等（1985）从来自水稻的菊欧氏杆菌(离提取一种细菌素，通过试验研究证明，细菌素是一种细产生的对不同细菌系或亲缘的有拮抗作用的抗菌物质其成份主要为蛋白质、多肽、核苷酸、生物碱类。任欣正等（193）从青枯假单孢菌(株04提纯出具有生物活性的细菌素，分子量为有蛋白质性质，含健胜等（199）利用从水稻的菊欧氏菌中分离到的细菌素防治番茄早疫病（水稻白叶枯病（小麦纹枯病（辣椒疫霉病（前产生细菌素的细菌主要种类有：土壤放射杆菌(丁香假单孢菌(密执安棒形杆菌(菊欧氏杆菌(甘蓝黑腐黄单孢菌(这些产细素的细菌进行生防时，可以直接用于大田防治，如对细菌性冠瘿病（青枯病(防治（979）。国外已有学者探索植物病原细菌的细菌素纯品或粗制品对植物病害的预防作用,如982)用丁香假单孢菌素4A(种或喷雾处理防治细菌引起的菜豆疫病。据研究报道，细的主要作用是抑菌而不是溶菌作用或杀。国外自983)首次在986；987），有人认为产生细菌素的特性是由独立于染色体外的质粒基因控制的（杨国平，1986）。中约为20也有证据表明，细菌素的产生受染色体基因和质粒基因双重调控，有的细菌素的产生与分泌的胞外多糖有关（978）。由于胞壁结构的不同，革兰氏阳性菌产生的细菌素与革兰氏阴性菌产生的细菌素在大小和特异性方面有相当大的差异。一般来说， 阳 细的抗菌谱要比革兰氏阴性菌产生细菌素广，但在正常情况下，革兰氏阴性菌对革兰氏阳性菌产生的细素不敏感，除非细菌的外壁受到亚致死物或螯合剂的处理。革兰氏阴性菌含有外膜，细菌素通过与外膜上的特异性受体结合，然后通过特异性的转导过程到达其作用位点。相比之下，革兰氏阳菌的细胞壁是由肽聚糖组成，没有外膜，这样低分子量的细菌素不必通过与膜受体结合与特异性的转导作用就能穿过细胞壁而发挥作用。产生肽类抗生素，这些抗生素的肽链多呈闭合环状，几乎没有游离的氨基和羧基，能忍受蛋白酶的作用（93），但也有对蛋白酶敏感（游春平等2