【毕业学位论文】牛卵母细胞胞浆内单精子注射的研究硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 牛卵母细胞胞浆内单精子注射的研究 on in 士 研 究 生：张营霞 指 导 教 师：朱化彬 研究员 申请学位类别：农学硕士 专 业：动物遗传育种与繁殖 研 究 方 向： 动物繁殖生物技术 培 养 单 位： 北京畜牧兽医研究所 研究生院 提交日期 2007 年6 月 on in s. 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 摘 要 卵母细胞胞浆内单精子注射（术已经在许多物种上获得成功，但目前 研究借助显微操作仪将牛精子注入经体外成熟 2226对注射卵进行体外培养，观察其存活及发育情况，探讨了显微操作注射针、肝素、卵母细胞成熟时间及离心与否、精子状态及预处理对牛 胎体外发育的影响，研究结果如下： 试验一，用外径为 35m 的注射针进行显微操作的注射卵存活率、卵裂率和囊胚率均显著高于810m 注射针处理组（ （p,表明用外径为 35m 的注射针进行显微操作的效率高于用 810m 注射针进行注射。 试验二，在受精液或胚胎培养液中添加肝素处理组的注射卵卵裂率和囊胚率分别为 及 显著高于在上述两种培养基中均不添加肝素处理组的注射卵卵裂率和囊胚率（和 （ p，表明在受精液或胚胎培养液中添加肝素能够显著提高牛 率。但与只在受精液或胚胎培养液中添加肝素相比，在两种培养基中均添加肝素并不能提高注射卵的卵裂率和囊胚率( ( p。 试验三，卵母细胞体外成熟 24h 或 26h 后再进行显微注射，其注射卵的卵裂率和囊胚率均显著高于体外成熟 22h 处理组的注射卵卵裂率和囊胚率（ ， （ p；但卵母细胞体外成熟 246h 处理组的注射卵卵裂率及囊胚率没有显著差异（ ， ） (p，表明用体外成熟2426率。 试验四，注射精子头处理组能够获得比注射活精子或死精子处理组更高的注射卵存活率（ ）（p ；注射活精子处理组的注射卵卵裂率和囊胚率显著高于注射死精子和精子头处理组（ 和 （p 但注射死精子处理组与注射精子头处理组之间的注射卵卵裂率和囊胚率没有显著差异（ ）( p，因此，为了获得较高的 胎发育率，应选择整个活精子进行显微注射。 试验五的研究结果表明， 卵母细胞离心对牛 ， ） (p。 试验六的研究结果表明， 对精子用 行预处理可以显著提高 射卵的卵裂率和囊胚率（ （p 关键词：牛，卵母细胞，精子，显微受精， is a of of of is To of in 2an by of a of on in to in In , of it of （p In , or ）（ p 0g/mL in in of (p In , in it 4h 6h 2h （ ( p So a in In , or or （p （ p In , it of of ，( p In , TT it TT of of ）（p I 目 录 第一章 文献综述 . 1 言 . . 卵母细胞的收集和处理精子或精核的准备精子或精核的显微注射注射卵的激活 影响. 精子因素 卵母细胞质量与状态及预处理对果的影响显微操作过程对果的影响注射卵的激活方法对果的影响. . .牛卵母细胞胞浆内单精子注射的研究（试验研究） . 16 言 .料与方法 . 实验材料 . 溶液的配制 . 实验方法 . 20 验设计 .验结果 .分析与讨论 .三章 全文结论 . 38 参考文献 . 39 图片及说明 . 51致谢 . 53 作者简历 . 54 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 血清白蛋白 线菌酮 丘卵母细胞复合体 胞静止因子 6 二甲基氨基嘌呤 甲基亚矾 硫苏糖醇 二醇 牛血清 FN 原核 卵泡激素 胱甘肽 GV 发泡 质内单精子注射 磷酸肌醇 in 外培养 in 外受精 in 外成熟 LH 黄体素 M 二次减数分裂中期 MN 原核 熟促进因子 PB 体 乙烯吡咯烷酮 RS 形精子细胞 SP 子因子 下注射 ZP 明带 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 第一章 文献综述 言 卵母细胞胞浆内单精子注射技术（简称 20 世纪 80年代发展起来的一种辅助生殖技术，该技术借助显微操作仪，将单个精子或精子细胞直接注入卵母细胞胞浆内，从而完成受精，因此，又称为显微受精技术。由于该技术绕过了透明带和卵子质膜对精子入卵的阻碍，对精子的活力及完整性没有严格要求，只要精子基因组完整就能与卵母细胞完成受精过程，产生正常后代。因此，该技术在动物受精生物学研究、畜牧业生产以及治疗人类不育的临床实践中都有极为广阔的应用前景。首先，利用 术可以进行同种和异种动物受精机理的研究，如同种和异种配子间质膜的融合、卵母细胞的活化以及雄原核（的形成等，对于解决发育生物学和生殖生物学中的相关受精机理问题具有重要的理论意义。其次， 术可以提高良种公畜和珍稀野生动物的精液利用率。再次，利用 术可以将形态异常、活力低甚至不运动的精子注入卵母细胞内，并完成受精，因此，该技术对于治疗人类、良种公畜和珍稀野生动物的某些雄性不育症具有重要意义。此外， 术与其他生物技术相结合，能够用于生产转基因动物，并可提高家畜育种的效率，促进性别控制技术的推广应用。 术的研究简史 最早的 究可以追溯到 20 世纪初 海星上做的试验，当时为验证精子能否不通过海星鞘使海星受精的构想，活的海星精子注射到海星卵内，观察注射后海星卵的反应，尽管 每个卵里注射了 212 个精子，海星卵依然无一受精， 而得出结论，精子穿透海星鞘是精子激活卵子的前提条件（913 ）。时隔多年之后， 1962）在海胆上也做了类似的试验，起初，结果也并不理想，单个海胆精子注入海胆卵内，精子头在海胆卵内也不发生变化，但 后发现，当海胆卵辅助以外部受精时，注入卵内的精核却可以解聚形成多精受精， 试验充分说明 子解聚的条件是卵胞质的激活(962) 。接着，在 1974 年， 射了 562 枚爪蛙卵，获得 4 只形态正常的爪蛙，这是 功获得后代的首次报道(974) 。 最早对哺乳动物进行 究的是 们将仓鼠和人的鲜精、冻精和冻干精子分别注入仓鼠卵母细胞内，观察到两种精核均能解聚并形成雄原核，证明雌雄配子质膜融合并非精核解聚和原核形成的必需条件( 1976)。 1980 年， 大白鼠、小鼠、白脚鼠的精卵互作进行了研究，发现在异种受精中卵母细胞的透明带具有种的特异性，但是精子在卵母细胞膜内的解聚及原核形成并没有很强的种属特异性。由此证实了利用 助受精技术进行异种受精的可行性，弥补了一般体外受精（术的不足（1980 ）。 显微受精技术取得突破性进展是在 1988 年， 首次得1 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 到成活后代（ 1988） 。同年，报道兔 1988 ） 。此后， 后在小鼠(988; ， 1992； 1994；995) 、大鼠（003）、兔（，1988；1988；，2001 ）、牛（ 1990； 1999； 2002； 2002； 2003） 、猪（ 000） 、绵羊（ 1996） 、马（ 2001） 、猫（ 1998）、恒河猴（，1999）等动物和人（， 1992）上获得成功。但是，小鼠术一直进展缓慢，主要是由于小鼠卵母细胞抗损伤能力差，胞质在注射精子后经常迅速崩解。直到 1995 年， 改进了显微操作系统，应用置进行小鼠作，初步解决了注射卵的成活问题（，1995）。 再应用统注入精子，获得了小鼠代，并使小鼠注射卵的成活率由 16提高到 80，囊胚率由 33%提高到 68，产仔率达到 30（ 995）。 、马的得到应用。 1999 年， 果表明，受精率和囊胚发育率显著高于传统而且，在牛射卵激活与否，对受精率没有影响，因此，注射卵的激活对是必需的（1999）。 统进行人究，大大提高了受精率和卵裂率（ 2001）。 术使精子越过了透明带（和卵质膜所形成的受精屏障，克服了受精的种属特异性，使异种受精成为可能。最早利用 术进行异种精卵互作研究的是 ，他们将人和多种哺乳动物的精子如小鼠、兔、牛及大鼠精子注入仓鼠卵胞质内均可形成雄原核，但体外发育十分困难（， 1976）。 小鼠精子头注入大鼠卵胞质内，注射卵被激活，完成减数分裂并形成雌原核（，注入的精子形成雄原核并与雌原核结合，异种胚胎体外培养可形成 2细胞（ 1980）。 道了将兔的精子核注射到兔和仓鼠卵胞质内，精核都能解聚，并发育形成雄原核（1989）。 分别将猪、牛、小鼠和人的精子注入猪卵母细胞中，均能激活卵母细胞，形成原核，原核形成率之间没有显著差异（， 1999）。 将冷冻致死的绵羊、鲸鱼和牛的精子注射到牛卵母细胞中，原核形成率分别达到 但是只有同种注射的卵母细胞能发育到囊胚（， 2000）。陈大元等将大熊猫精子注入金黄地鼠卵周隙中，李子义等将小鼠精子分别注入兔卵胞质和卵周隙中，均能激活卵母细胞，使之发生皮质层颗粒反应，导致原核形成，其中鼠兔异种胚胎经体外培养发育到了 8细胞期（陈大元等，1996 ） 。在研究异种间的核质作用关系方面，将小鼠卵母细胞的生发泡移植到去核的兔同期或不同期卵胞质中，重构配可成熟至 M期。将小鼠精子注入生发泡互换后的成熟兔卵母细胞中，受精卵发育至 2细胞期和 8细胞期（，2001 ）。牛向丽进行了水牛和黄牛种间的异种受精研究并取得了较好的体外发育效果（牛向丽，2003 ）。 就受精能力而言， 研究发现，精子的表型不完全反映其基因型，以小鼠为研究模型发现形态和活力异常的精子，在体内外正常条件下不能使卵母细胞受精，但利用 术，将这些异常精子注入卵母细胞中，可以完成受精，说明形态和活力异常的精子其基因组不一定异常（ 1976； 1983； 1984）。 言，注射的精子不管形态是否正常或死亡与否，只要其基因组完整，就能参与胚胎发育，产生正常后代（ 1976） 。这一发现不仅使死精子和形态异常的精子能够正常进行受精，而且也使得变态前后的各级生精细胞参与受精成为可能。首次将仓鼠球形 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 精子细胞核注入成熟的卵母细胞中，发现精核可以发育成具有 成活性的雄原核，并最终能与雌原核结合（， 1993）。同年， 分别将仓鼠和小鼠的球形精子（细胞注入卵周隙中，然后施加一直流电脉冲，使精子细胞融入卵母细胞，分别获得了 2040和 30的融合率，并获得了试管小鼠（，1993 ）。报道利用兔球形精子（细胞核进行 究获得成功并产仔（，1994 ）。1995 年， 用 统提高了小鼠 成功率后，又在小鼠睾丸生精细胞的 究中取得了很大进展，他们将小鼠次级精母细胞核注入电激活的小鼠卵胞质内也获得成功，产下试管小鼠。小鼠球形精子细胞和次级精母细胞 代的诞生表明小鼠雄性生殖细胞的基因印迹在精子细胞期已经完成（ 1995）。将牛睾丸中分离的精子细胞和经次级精母细胞体外得到的精子细胞分别注入体外成熟的牛卵母细胞胞浆内，囊胚发育率分别为 ， 1996）。 1999 年， 胚发育率分别为25和 27（ ，1999）。 首次报道将人精子直接注入卵胞质后形成原核（，1988 ）。1992 年，成功应用 术获得健康婴儿，从此人类对男性不育症的治疗翻开了新的一页（ ,1992）。 先报道了人球形精子细胞的 验(994)。1995 年， 应用精子细胞进行 得成功并分娩健康婴儿，对非阻塞性无精症的治疗研究取得了突破性进展，从而使 术的应用前景更加广阔（， 1995）。20 世纪 90 年代，大批显微受精的试管婴儿相继在澳大利亚、美国、加拿大、法国、新加坡等国家诞生。目前，人精子胞质内注射的受精率高达 6070，胚胎着床率也达到 20以上。显微受精已发展成为帮助男性不育家庭生育后代的理想手段。 我国的 术研究起步较晚，但也取得了一定进展。 1992 年，卢圣忠进行了牛和猪的 究，牛注射卵的受精率为 猪注射卵的受精率为 卢圣忠，1992 ）；1993 年，罗军等报道兔精子胞质内单精子注射获得成功并产下 4 只仔兔（罗军等，1993 ）；1993 年，陈大元等进行金黄地鼠精子带下注射（，通过探针原位杂交发现卵母细胞透明带内表面也存在精子抗体，据此提出了受精存在一级识别和二级识别的论点，对于受精机理的认识产生重要推动作用（陈大元等， 1993）； 1995 年，曾嵘等以带下受精法获得两只仔兔，而胞质内注射没有获得后代（曾嵘等， 1995）； 1996 年，黄振勇和陈大元等用小鼠卵母细胞质内单精子注射获得了小鼠后代（黄振勇等， 1996）。在生精细胞 996 年，刘灵和陈大元等进行小鼠球形精子细胞带下受精研究获得成功，产下12 只仔鼠，产仔率达 这是我国首例用球形精子细胞产下的试管小鼠（刘灵等， 1996）；1999 年，李子义等进行小鼠精子和球形精子细胞的 究，注射卵的存活率、受精率、卵裂率和囊胚率分别为 李子义等， 1999）；另外，陈大元等和李子义等还进行了大熊猫和兔的异种受精研究并取得了一定进展。在近年的研究中，黄振勇和陈大元等发现精母细胞和卵母细胞在同步发育过程中，卵母细胞质中的减数分裂促进因子能激活精母细胞和卵母细胞同时进行减数分裂，排出极体（ ，出现 1 个受精卵排出2 个雌极体和 2 个雄极体的现象，胞质中呈现双原核的情形；高绍荣与陈大元最近研究发现精母细胞与卵母细胞同步发育过程中，存在染色体融合之后减数分裂排出 4 倍体的第一极体3 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 和 2 倍体的第二极体，胞质中含 2 倍体的合子核现象（黄振勇等， 1998）。在人的 术研究方面，中山医科大学附属医院庄广伦等 1996 年首次在我国获得成功，打破了我国显微受精试管婴儿“0 ”的记录。随着实验室各项技术的成熟，我国的试管婴儿成功率由原来的25 30提高到现在的 60，甚至是更高水平。 术的基本操 作程序 卵母细胞胞浆内单精子注射技术的基本程序包括精子和卵母细胞的准备、显微注射、注射卵的激活以及注射卵的体外培养等。 母细胞的收集和处理 卵母细胞来源主要有两种：一是经超排处理获得的动物体内成熟的卵母细胞；二是从屠宰场收集卵巢，抽取未成熟的卵丘卵母细胞复合体（，然后经体外成熟（培养获得。显微注射前，卵母细胞要用 透明质酸酶进行消化，以除去其周围的颗粒细胞，然后置于覆盖有石蜡油的卵母细胞操作液中备用。对于脂肪含量较高的卵母细胞（如牛和猪），可对其进行离心处理，以使卵母细胞中的脂肪滴被甩向一侧，使卵母细胞质变得透明，以利于显微操作。 子或精核的准备 新鲜或冷冻解冻的精子均可用于显微注射，使用前需要根据试验设计做若干处理，如精子获能及超声波处理；精子的冷冻解冻处理；除去精子尾部及顶体制备精核；精子孵育液中加入聚乙烯吡咯烷酮（ ，一方面使游动的精子丧失运动能力，以便于注射时捕捉精子，另一方面经这样处理的精子不容易粘在注射针管壁上，有利于精子的释放；精子孵育液中加入二硫苏糖醇（简称 对某些种类动物精核的解聚有一定作用，可以提高雄原核的形成率。 子或精核的显微注射 显微注射有传统和 作系统两种方法，两者主要在注射针及驱动力上有所区别。显微注射针的内径只能比精子头部的直径稍大一点，各种动物精子头部的直径不同，所用注射针的直径也不同，小鼠精子的注射针内径一般为 5m ，人注射针的内径一般为 7 m，牛注射针的内径为 810 m。对于传统 射针要磨出一个斜面（一般为 304 5） ，而 作系统使用平口针即可。 显微操作时，如果用有活力的精子做注射，则要挑选活力好的精子，破坏其尾部中段很小部位的质膜，使其失去活动能力，这个过程即称为制动。因为在正常的受精过程中，精卵质膜融合，精子在卵母细胞质中释放一种启动卵母细胞激活的因子精子因子（ 起卵母细胞胞浆内的度波动，从而激活卵母细胞。制动的目的就是使精子注入卵胞质4 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 后能够较快的释放精子因子（精子制动的方法是影响精子因子能否快速释放的重要因素，最常见的方法是用注射针挤压精子尾部进行制动，也有人采用显微操作刀切断精子尾部的方法，最近有报道表明用激光进行制动可以提高制动的效率，保证了精子尾部中段质膜的破裂。精子制动后，将其从尾部吸入注射针开口端。注射时，用固定针固定卵母细胞，并用注射针轻轻拨动卵母细胞，使极体位于“6 ”点或“ 12”点位置，注射针在“3 ”点位置穿过透明带，向“9 ”点方向深入卵胞质，先回吸少量卵胞质，以确定质膜已破裂，再将单个精子连同微量精子操作液注入卵胞质内。 注射卵的激活 除了小鼠、兔、人的卵母细胞受到显微注射针的刺激就可以直接被激活外，其他哺乳动物的卵母细胞，如果不用额外的激活处理，其激活率很低。目前常用的激活注射卵的试剂有乙醇、钙离子载体（、离子霉素（、 6二甲氨基嘌呤（6 和放线菌酮（等。此外，还有物理激活，如电击等。激活效率与激活方法和卵母细胞状态有关。 精卵的培养 目前，受精卵的培养方法有体内和体外培养（两种。体内培养就是在注射卵激活后，体外培养到早期胚胎，再将其以琼脂包裹，移入暂时的中间受体（如羊、兔）的输卵管内，培养 4 5 天，当胚胎发育到桑椹胚或囊胚，再将其取出，进行胚胎移植。这种方法操作较为复杂，成本高，不利于商业化生产，因此，现在一般采用体外培养的方法，即利用输卵管上皮细胞或颗粒细胞做成滋养层与受精卵共同培养。虽然用体细胞与胚胎共培养可以克服大多数哺乳动物胚胎体外发育的阻滞现象，使显微受精胚胎发育至囊胚时的细胞数和分化程度与体内受精胚胎没有差异，但是体外培养时间延长可能会影响胚胎移植到受体后的发育，造成胚胎和胎儿死亡增加。体外培养系统是否过关是直接影响显微受精和卵裂的关键因素。因此，不断地改进体外培养系统，是提高显微受精效率的有力保障。 响 率的主要因素 目前，大量的研究结果表明有几个关键性的技术因素影响着 成功率，主要包括精子因素、卵母细胞质量与状态、显微操作方法、注射卵的激活方法及体外培养方法等。 子因素 越了透明带和卵子质膜所形成的受精障碍，因此受精过程大大降低了对精子本身质量的要求，精子的死活、获能和顶体反应不再是受精的必需条件，甚至不同发生阶段的 精子细胞也能通过 术实现受精（， 1990； ， 1992； ， 1997）。 5 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 子新鲜和活动与否对 果的影响 1976 年， 道新鲜、冷冻解冻及冻干的人精子注射到仓鼠卵母细胞内均能发育形成雄原核（，1976 ）。此后，将兔的不运动的活精子注射到兔卵胞质内，获得了胚胎，移植后，成功产下仔兔（， 1988）。 1993 年， 和 比较试验，结果表明，精子经钙离子载体 头公牛的体外受精率分别为 80、 54、 1和 2，在不加冷冻保护剂的条件下，将精子于2 5冷冻处理以停止其运动，然后进行 受精率分别为 39、22、21和 34， 精率差异不显著，表明冷冻精子和不活动精子同样可以获得理想的 精率（ 993 ）。 子完整与否对 果的影响 早在 1976 年， 道，将仓鼠精子核注入卵母细胞质中，精核可以发育成雄原核。兔的精子核可以在兔和仓鼠卵胞质内解聚，并发育成雄原核（ 989）。 出， 精卵的微管星体是从精子颈部的中心体开始组装，并充满于整个卵母细胞质，这些雄源性的微管将雌原核迁移到卵母细胞的中央。因此，精卵与正常受精过程中的细胞骨架的变化相同。相比之下，精子头部显微注射得到的受精卵，由于精子颈部被去掉，精子星体无法组装，然后充满于整个卵母细胞质，这种微管组织方式与孤雌激活的卵母细胞相似。可见，当卵母细胞中没有精子中心体存在时，卵母细胞可以通过自身组装微管而正常受精（1998 ）。 子死活对 果的影响 1992 年，高温法杀死精子进行注射，以分析精子的耐热性。在试验中别采集仓鼠、小鼠、人、马和鱼的精子，用超声波去除质膜、顶体及精子尾后，精核于 6012 5水浴或蒸汽中处理 20120 分钟，然后将单精子核注入仓鼠卵母细胞质内。结果表明，精核于 90条件下处理 30 分钟，仍具有原核发育潜力。将仓鼠精子核完全灭活的温度提高到 125，精子核虽然可以解聚，但却不能形成雄原核。这一结果表明，精核对高温具有很强的耐受性，死精子同样具有受精和发育潜能（1992）。 子发生阶段对 果的影响 精子发生是一个复杂的过程，精原细胞经历数次有丝分裂形成初级精母细胞，初级精母细胞再经第一次减数分裂形成次级精母细胞，然后再经过第二次减数分裂形成单倍体的球形精子细胞，球形精子细胞发生变态，脱离曲精细管后，依次经过附睾头、附睾体和附睾尾，最终发育为成熟的精子。不同发育时期的生精细胞，其成熟程度不同，受精潜力也不同。一般认为，附睾尾或射出精子是最后成熟并具有受精能力的精子。但在 ，不同发生阶段的精子能够获得相似的注射效果，这已经在多种动物上得到证实。小鼠睾丸精子 精后，注射卵发育至 2细胞、4细胞、桑椹胚和囊胚的比率分别高达 99、98、89和 70，移植 44 枚 2细胞胚胎，顺产仔鼠 24只，产仔率为 ，1995） 。牛的比较试验表明，睾丸或附睾（头、体、尾）和射出精子的 精卵发育至 28 细胞6 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 和桑椹胚的比率分别为 差异不显著，但睾丸和附睾头精子受精卵发育至囊胚的比率（ 显著高于附睾体、附睾尾和射出精子（的受精卵。由于牛 射卵不易被激活，所以与其他物种相比，精子细胞 胚胎发育率较低，需要通过优化卵母细胞激活方法来获得较高的球形精子率（ ，1996） 。1994 年，报道了兔球形精子细胞核 得成功，实现妊娠，并顺利产仔（，1994） 。， 将猪球形精子细胞和球形精子细胞核分别注入到已电激活的卵母细胞质内，体外培养囊胚率分别为 25和 27（999） 。在我国，李满等比较了人射出精子、附睾和睾丸精子 果表明其受精率、卵裂率及妊娠率均无显著差异（李满等，1998)。1995 年，日本科学家首次报道了人类球形精子细胞 得妊娠，但于妊娠早期发生流产（ ，1995） 。同年 胞进行 功分娩健 康婴儿。对于有些男性患者，通常由于精子活力低或无精子而不能进行传统的 能用睾丸内各级生精细胞进行 ，1995） 。近期研究结果表明人睾丸精子细胞的 娠率显著低于射出精子的 娠率（，2002） 。 子预处理对 果的