【毕业学位论文】禽流感病毒血凝素的原核表达及重组蛋白芯片平台的构建硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 禽流感病毒血凝素的原核表达及重组蛋白芯片平台的构建 士研究生：王 昱 指 导 教 师：王秀荣 副研究员 申 请 学 位 类 别 ： 农学硕士 专 业：预防兽医学 研 究 方 向：禽流感分子生物学 培 养 单 位：中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 u 007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 中国农业科学院 硕士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 禽流感病毒血凝素的原核表达及重组蛋白芯片平台的构建 论文作者 王昱 专 业 预防兽医学 研究方向 禽流感分子生物学 指导教师 王秀荣 培养单位（研究所） 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称 硕（博）导师 单 位 专 业 签 名 魏萍 教授 博导 东北农业大学预防兽医学 评 阅 人 王笑梅 研究员 博导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 答辩 主席 李一经 教授 博导 东北农业大学预防兽医学 李书华 研究员 硕导 黑龙江省兽医局 预防 兽医学 王云峰 研究员 硕导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 辛九庆 副研究员 硕导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 刘明 副研究员 硕导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 答 辩 委 员 会议记录（秘书） 曾显营 论文答辩时间地点 哈尔滨兽医研究所学术报告厅 2007 年 6 月 12 日 I 摘 要 禽流感是由正粘病毒科流感病毒属 A 型流感病毒所引起的的禽类的感染和/或疾病综合征，其中高致病性禽流感被世界动物组织定为 A 类传染病。禽流感病毒的常规检测方法涉及到针对病毒抗原及病毒特异性抗体两类。常规的抗体检测方法是琼脂扩散,酶联免疫吸附试验及血凝抑制实验。 蛋白质芯片技术（被称为蛋白微阵列（一种快捷、高效、并行、高通量的蛋白质检测技术,可以应用于并行地检测数百个疾病相关分子。该技术平台的构建涉及到合适载体的选择、样品的制备及点样固定、抗体的杂交及非特异吸附物质的洗涤等。将蛋白芯片技术应用到动物病毒性疾病的检测是芯片技术的重要内容之一。 本研究旨在构建并优化一种基于重组蛋白抗原芯片的可以灵敏地检测鸡血清中流感病毒特异抗体的检测技术。通过原核表达系统 血凝素蛋白，将纯化后的重组血凝素蛋白作为芯片的捕获抗原点样固定到芯片载体上，以类似直接 模式检测血清中的禽流感病毒抗体。研究内容主要包括: 1蛋白抗原的制备：应用 法扩增得到了三株禽流感病毒的全长血凝素基因，酶切物，接酶连接到 体中，经 切及测序验证为正确后，转化 肠杆菌中，添加 行诱导。在诱导结束后将表达菌通过超声波裂解及尿素的洗涤进行初步纯化，且通过 联的亲和层析柱亲和层析进一步纯化。最后，重组蛋白通过透析进一步纯化并复性，免疫印迹表明三个重组蛋白均具有良好的抗原性。 2芯片的制作及条件优化：将纯化的蛋白抗原用点样仪点击到氨基或环氧基修饰的玻璃载片表面，并选择了多种点样缓冲液并测试了不同的温度、湿度下点样的效果；比较了以脱脂乳、牛血清白蛋白及胎牛血清三种不同的封闭剂进行封闭的条件下样点的信噪比、荧光密度平均值高低并确定了芯片的最佳的封闭条件；并利用方阵试验的方式确定了最佳的一抗及二抗的稀释度。最后，用构建的芯片检测梯度稀释的血清，确定了芯片的检测限及线性范围。 总言之，本研究确定了三种亚型禽流感病毒血凝素基因的不同的诱导表达条件，获得了该基因在大肠杆菌系统中的超量表达，且优化了重组血凝素蛋白的纯化步骤及复性条件；同时，还初步建立了利用重组蛋白抗原检测血清抗体的基于芯片的检测方法，构建的蛋白质芯片样点形态规则，且具有良好的再现性和较小的变异度，其线形检测区间同比间接 法宽，灵敏度是相同捕获抗原建立的间接 研究为下一步高密度芯片的制备奠定了基础。 关键词 禽流感 ；重组血凝素；表达；纯化；蛋白芯片；构建 is an or in by in of is ” by to to so is a of of or be to of of of of of of of to is of of In it to a of as to in in by A to (1) of of CR by II 4 to to (2) of of or by of by of to s by of to In of of of to up of .5 of of 录 第一章 文献综述 .流感病毒简介 . 1 禽流感病毒 (态结构 . 1 禽流感 (毒的生物学特性 . 1 . 4 . 4 人流感相关的禽流感事件 . 4 清学诊断技术 . 5 原学检测技术 . 7 子诊断技术 . 8 白质芯片技术研究进展 . 9 白质探针的制备 . 9 片载体的类型及选择 . 10 样方式的选择 . 10 应条件的优化 . 11 号检测方式 . 11 白芯片技术在兽医诊断学上的应用 . 12 究目的和意义 . 12 第二章 试验部分. 13 白抗原的表达、纯化及抗原性鉴定 . 13 料和方法 . 13 果 . 20 论 . 25 白芯片的制作及优化 . 26 2. 2. 1 材料和方法 . 26 2. 2. 2 结果 . 30 2. 2. 3 讨 论 . 60 第三章 结论 . 63 结论一：. .论二：. .论三： .考文献 . 谢 . 者 简 历 . 75 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 流感病毒 喷雾点样 油 高致病性禽流感 疫荧光技术 基于核酸序列的扩增技术 多聚赖氨酸 白芯片 样缓冲液 5 组 型禽流感血凝素7 组 型禽流感血凝素9 组 型禽流感血凝素 糖核蛋白 毒核糖核酸 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1第一章 文献综述 流感病毒简介 禽流感病毒(态结构 禽流感病毒粒子在电镜下呈近似椭圆形或长丝状，其直径为 80 120右 (et 1981)，流感病毒具有囊膜，病毒表面有两种突起 白镶嵌在来源于宿主细胞膜的脂质双层中， 白和三种聚合酶蛋白（ 八段 起构成核糖核蛋白体（ ， 白将病毒囊膜与 接起来，而 白通过与 白相互作用间接地与 生联系， 白是 有的一种非结构蛋白质 (et 2001)。 毒粒子存在于感染细胞的胞浆、表面和间隙，主要以胞膜上出芽的方式成熟和释放，也可以从胞浆中的空泡膜上出芽成熟。 图 1流感病毒结构示意图 he 禽流感(毒的生物学特性 正粘病毒科流感病毒属 A 型流感病毒 (et 1987)， 为 8 个节段的负链 大到小依次为 M、 编码 10 个病毒蛋白，其中8 个是病毒的组成成分（ ，长度最小的 因编码两个非结构蛋白 感病毒基因组片段具有共同的特点：具有高度保守的 5和 3末端。每个 段的 5 末端均由 13 个高度保守的核苷酸组成，即3 3末端由 12 个核苷酸组成，即 3在这中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2些共有序列中，可部分互补，形成锅柄环状结构，该结构是病毒 合酶结合所必需的核苷酸识别位点 (et 1980)。研究表明，流感病毒的致病性取决于宿主与病毒之间的关系，病毒的八个基因节段对应八种不同的表达产物，各自在病毒的抗原性及感染性发挥各自的作用(2006)。 凝素（ 多年的研究证明： 白是流感病毒的主要保护性抗原，同时也是流感病毒抗原亚型分类的一个重要标记抗原。 血凝素 片段 4 编码，是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，为 75 I 型糖蛋白 ,具有血凝活性。在病毒吸附及穿膜的过程中起关键作用 (et 2002)。 感染过程中可被水解为两条肽链 产生感染的先决条件 (et 2003)。 白也是流感病毒刺激机体产生坚强免疫力的蛋白，该蛋白可刺激产生坚强的免疫保护性作用，同时诱导产生中和抗体。另外 变异性很强，是病毒亚型众多和抗原性发生变异的主要原因(et 1987)。 氨基酸序列决定 抗原性差异，抗原位点的单位点突变就可以改变糖蛋白的结构，并导致抗原变异 (et 1987)，各亚型间 异达 30或更多(et 1996)，而不同亚型的 白之间的交叉保护性极低。目前所有禽流感疫苗的开发研制都主要是针对该蛋白而来 (et 2005)。 经氨酸酶（ 神经氨酸酶蛋白与血凝素蛋白一样， 也是流感病毒重要的表面糖蛋白， 但与 一样的是，它属于 糖蛋白， 在病毒囊膜中， 氨基端定位于囊膜内而羧基端位于囊膜外， 与 好相反。其成熟的形式是具有催化活性的四聚体，能将唾液酸从糖蛋白和糖脂中切开。 重要功能是在病毒感染到靶细胞之前，将出芽的病毒粒子从宿主细胞表面释放出来清理通道（如降解细胞外的黏液受体物质） 。 不是宿主细胞膜与病毒粒子融合时必不可少的。 从病毒和感染的细胞上除去唾液酸残基 (et 1987)。这一功能对病毒粒子以及防止病毒粒子聚集是非常重要的。通过对温度敏感突变株 研究发现， 直接参与病毒的装配和出芽 (et 1982)；另外， 与病毒的宿主特异性及病毒的致病力有关。 合酶 ( 流感病毒的聚合酶是由 3 个最大的 段（ 1 3）编码的三种蛋白质，分别为 A。其中 碱性蛋白， 酸性蛋白。三种蛋白结合在一起起着病毒基因复制酶的作用， 进行子代病毒的复制和 产生， 是启动病毒复制的必须酶系统 (et 1981)。目前 3 个聚合酶和核以及核糖核酸的复合物的三维结构以及在 的定位基本清楚，对于进一步研究提供了良好的信息 (et 2004)。 已有研究表明 病毒对不同宿主致病性相关， 第 627 位氨基酸的变化对于病毒感染哺乳动物的能力有着极大的影响力 (et 2004)。 于病毒的复制和转录调控以及病毒的宿主特异性 (et 2001)也有着重要的作用。 蛋白 (P) 白是流感病毒粒子核衣壳中主要的结构蛋白。在流感病毒的各个基因中， 因最为保守，具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为 A、 B、 C 三个型。核蛋白是一种单体的磷酸化多肽， 在病毒感染中发挥多种功能。 核蛋白除了形成病毒的核衣壳外， 可使 第一章 文献综述 3形成 合体以此来稳定 其免受 用。另外在病毒基因组的转录和复制过程中也起重要作用，核蛋白在病毒复制过程中对病毒基因组 细胞核内外的运输和蛋白的定位有着重要作用 (et 2004; et 2004)。此外 磷酸化蛋白，在体外仍具有磷酸化活性，不仅可催化其他底物而且能够催化自身磷酸化 . 核蛋白的磷酸化取决于宿主，与流感病毒的宿主谱有关 (et 1976)。 细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原，在蛋白上至少具有 3 个独立的抗原位点。通过用单克隆抗体和多克隆抗体进行研究发现所有毒株都有一个共同位点，这一位点的单抗能抑制病毒子的体外转录。针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供被动保护 (et 2000)， 用提纯的核蛋白免疫动物， 也能产生很微弱的抗感染能力 ,但不能保护动物发病和死亡 (et 1990)。 结构蛋白 (S) 因有两个读码框，编码 种蛋白质，其中 非结构蛋白， 结构蛋白，这两种蛋白仅在被流感病毒感染的细胞中发现，而病毒粒子内不存在这两种蛋白成分。白有多种功能，它可干扰 体的剪切 (et 1994)，干扰 )的形成，以及干扰细胞 细胞核进入细胞质 (De et 1995)，还可以使依赖 蛋白激酶失去活性。 流感病毒感染细胞过程中起重要的蛋白表达调控作用。 方面可以通过促进流感病毒 翻译， 而增加病毒蛋白的表达， 另一方面可以通过阻止细胞 末端多聚腺嘌呤化和抑制细胞 细胞核运输到细胞质中，抑制 干扰素基因表达 (et 2002; et 2002)。 918 年世界性大流感的病毒株的毒力有关。 白的主要功能是介导组装好的 细胞核中输出到细胞质中，该功能通过 白与 生联系而起作用 (Oet 1998; et 2001)。 质蛋白 (M) 流感病毒的基质蛋白有两种， 即 于病毒囊膜的类脂双层内侧核衣壳的外侧，是维持病毒形态的结构蛋白。 病毒粒子中最丰富的蛋白 , 占病毒粒子总量的 30 流感病毒的 有多种功能，除维持病毒粒子的形态外，还作为病毒转录、复制的负调控基因，能调节病毒转录酶的活性。还能促进流感病毒 细胞核内向细胞浆运输，并在病毒粒子出芽和装配过程中起着关键性的作用 (et 2001)。另外， 核衣壳和表面糖蛋白的胞浆区共同作用， 保证病毒粒子的完整性。 据报道， 克隆抗体不能给动物提供被动保护 (et 2006)。 一种跨膜质子通道蛋白，主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上，另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。每个病毒粒子大约含有 1468 个 子。 氨基酸序列很保守，在所检测的毒株中， 其同源性高达 90%(et 2004; et 2005; et 2005)。 主要作用是，在 成过程中作为质子通道控制高尔基体内的 ；在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境；另外在病毒装配过程中也起作用 (et 2006)。近来有研究表明，利用单抗结合了流感病毒 白和 T 细胞受体的双特异性抗体能有效抑制流感病毒的复制 (et 1988; et 1993; et 2005)。人们认为 是流感病毒的保护性抗原，而且其高度的保守性使 子有可能发展为具有交叉保护能力的流感疫苗的侯选抗原中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4(et 2005; et 2006)。 危害及公共卫生学意义 养禽业造成的危害 养禽业带来的损失是巨大的。自从 1959 年 次报道以来，每次 暴发都给养禽业造成了巨大的经济损失。其中以 1959 年英格兰 1983 1984 年美国宾夕法尼亚州、 1994 年墨西哥禽流感、 1997 年香港禽流感以及 2004 年东南亚更为著名。上个世纪，美国政府在 1983间为扑灭暴发于宾夕法尼亚 新泽西的高致病力禽流感的费用超过了 6 千万美元，主要用于诊断、检疫、禽群的隔离、环境的净化、消毒，流行病学的调查以及其它协调活动和赔偿禽场的经济损失等。经济损失不仅仅限于鸡，美国、以色列的火鸡生产者多年来也深受其害。 1978 年明尼苏达的一次禽流感流行使火鸡生产者的经济损失超过了 500 万美元。据估计，自 1977 年以来明尼苏达暴发禽流感总的经济损失要超过 1000 万美元。在中国，仅 2005年就暴发禽流感疫情 35 次，扑杀家禽 只。可见，多年来 直严重困扰着各国养禽业的发展 (2004; 2006)。 人流感相关的禽流感事件 在上个世纪，人类共发生了四次流感大流行。在 1918 年西班牙流感中共计有 2000 多万人死亡，仅美国就有近 70 万人患流感而死亡，对该病毒的遗传学分析表明，该病毒来源于欧亚大陆的禽流感病毒 (1992; et 1997; 2006)。 1997 年 5 月从香港一名死于重症肺炎的男孩体内分离到一株 型流感病毒： A/56/97(到 12 月 11日止共有 18 人确诊为 毒感染并发病，其中 6 人死亡。病毒序列分析表明，这些病毒与当时引起香港禽流感暴发的 型 度同源。 该事件的发生彻底打破了禽流感病毒不能突破种间屏障直接感染人的传统认识模式，使人们对 流感病毒是否具有引起人类流感大流行的能力倍加关注 (et 1998)。 2003 年 3 月，在荷兰暴发了 型禽流感， 4 月间，在禽流感疫区有多名与家禽有密切接触的人发生结膜炎或类似流感症状 （发烧、 咳嗽、 肌肉痛等） ，通过病毒分离鉴定，发现有 80 例为 性，另外在这次 型 发的过程中，导致一名兽医感染而死亡；在 2004 年，泰国、越南 型禽流感病毒感染人事件的先后出现；尤其是 2005 年来全世界大范围暴发禽流感，不仅是给养禽业造成毁灭性的打击，对人类的生命健康也造成极大的威胁，其中 主要的病毒感染亚型 (2006; et 2006)。近年来， 型禽流感病毒感染人的案例见表 1流感病毒跨越种间屏障，感染人类已经是既定的事实。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5表 15型禽流感病毒感染人事件的统计数据（ 2003 2003 2004 2005 2006 2007 总计 国家 感染 死亡 感染 死亡 感染 死亡 感染 死亡 感染 死亡 感染 死亡 阿塞拜疆 0 0 0 0 0 0 8 5 0 0 8 5 柬埔寨 0 0 0 0 4 4 2 2 1 1 7 7 中国 1 1 0 0 8 5 13 8 3 2 25 16 吉布提共和国 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 埃及 0 0 0 0 0 0 18 10 16 4 34 14 印尼 0 0 0 0 20 13 55 45 24 21 99 79 伊拉克 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 3 2 老挝 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 尼日利亚 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 泰国 0 0 17 12 5 2 3 3 0 0 25 17 土耳其 0 0 0 0 0 0 12 4 0 0 12 4 越南 3 3 29 20 61 19 0 0 0 0 93 42 总计 4 4 46 32 98 43 115 79 47 31 310 189 流感的实验室诊断方法及研究进展 型流感病毒的确切诊断依赖于病毒的分离和鉴定，检测病毒的抗体也是非常有效的间接诊断方法。因为临诊症状变化很大 ,除了疾病呈流行性外 ,临诊诊断常难以定性。因此 ,禽流感主要依靠实验室方法进行确切诊断 ,诊断方法主要包括病原学、 血清学和分子诊断三部分 (宋晓晖 ,等 , 2003;北方牧业 , 2003; 李文涛 ,等 ., 2005)。 清学诊断技术 脂扩散试验（ 即用已知阳性血清和未知抗原进行 验。受检样品是具有血凝素活性的鸡胚尿囊液。用来检测 A 型流感病毒群特异性血清抗体，即 M 抗体，因而适用于鉴定流感病毒。 此法虽然简单易行，但是敏感性低，易出现假阳性。 常用的是免疫双扩散，陈海燕等开展了禽流感病毒快速定型双扩散法的研究，不仅提高了其敏感度，且快速省时，在此方法基础上建立的 断技术及其诊断试剂盒。但由于方法自身在时效性，灵敏性方面的局限，本方法已渐渐被取代 (李坚 ,等 , 2004)。 凝和血凝抑制试验（ A; 流感病毒颗粒表面的 白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，同时， 白的抗体与该蛋白受体的特异性结合能够干扰 白与红细胞受体的结合。改良的 验方法测定抗体效价敏感度比常规方法高 2 倍 ， 若抗原用乙醚裂解， 其敏感性比常规法高 4 倍 ，但观察结果时间限制在 30 ，否则易出现假阳性。另外，非特异凝集素和非特异抑制素影响血凝抑制试验的准确性，也是常造成假阴性或假阳性的主要因素 (et 1973)。血清中非抗体物质可能结合到血凝素上导致非特异性抑制发生和错误结果出现，且血清中的唾液酸残基会模拟红细胞受体，同红细胞受体竞争与流感病毒血凝素结合，出现假阳性，为此应对血清进行处理，去除非特异性抑制物。同时，位于 子受体结合位点内或周围的氨基酸变化可导致流感病毒对一定红细胞敏感性的丧失，因此对一株新分离的病毒应筛选相应的红细胞用于 验。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6国内学者对琼扩及血凝抑制进行比较发现，血凝抑制在灵敏度和特异性上，均由于琼扩实验 (郝大丽 ,等 , 2005)。 经氨酸酶抑制试验（ 神经氨酸酶（ 流感病毒表面另一种糖蛋白，是一个头部有四个酶活性位点的蘑菇型分子，数量居第二位。 一种酶（唾液酸酶） ，它可以裂解细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基，这有利于病毒粒子从感染细胞中释放出来，及从新合成的 子上去除唾液酸。 另一作用是穿透呼吸道表面的粘膜，使病毒能够通过细胞表面在呼吸道中传播。 目前已知 A 型流感病毒有 9 个 型， 神经氨酸酶抑制试验主要用于流感病毒的表面抗原神经氨酸酶的亚型鉴定。 1983 年， A 等对常量 验方法进行了改造，建立了微量 验方法，既降低了