【毕业学位论文】（Word原稿）盐胁迫下植物组织中甜菜碱和脯氨酸变化的研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级 ： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 盐胁迫下植物组织中甜菜碱和脯氨酸 变化的研究 in of 摘 要 土壤盐渍化是一个 全球 性的资源和生态问题 ，己成为 限制世界和我国农业生产的主要因素之一。在耕地有限、人口不断增长的今天，开发和有效利用盐渍化土壤具有重要的现实意义，其中生物改良方法成为经济和有效的途径，揭示植物耐盐机理的研究成为生物改良方法的基础。 本试验通过研究甜菜碱和脯氨酸在植物体内的含量 变化以及和植物耐盐性的相互关系，建立植物耐盐性鉴定检测模式，为辅助农业种质资源鉴定、耐盐品种培育和耐盐基因的分离克隆提供依据。 试验中盐胁迫处理了 5 种植物 9 种试材，发现它们的耐盐性表现不同，按耐盐性由高到低排列为：碱蓬，甜菜和野大麦，耐盐小麦 通大麦条山，普通小麦宁春 4 号，盐敏感小麦中国春，耐盐大豆中野 1 号和盐敏感大豆 本研究建立了选择性强、灵敏度高的高效液相色谱 用技术分析盐胁迫下植物组织中的甜菜碱和脯氨酸方法。利用该方法一次性分析了甘氨酸甜 菜碱、 芦巴碱、脯氨酸甜菜碱、 4 种化合物，获得了较理想的定性、定量分析数据。 运用 术对盐胁迫下 5 种植物组织中甜菜碱和脯氨酸的含量进行分析。 方差分析结果显示： 5 种植物组织中甜菜碱含量存在差异，且达到极显著水平（ = 叶中甜菜碱含量最高为 低为 中甜菜碱含量最高为 低为 菜碱含量多重比较 ( = T= 果显示：甜菜碱 的含量碱蓬 野大麦 甜菜 耐盐小麦 通小麦宁春 4 号 普通大麦条山 盐敏感小麦中国春 耐盐大豆中野 1 号 盐敏感大豆 结果表明盐胁迫下甜菜碱的含量与 5 种植物的耐盐性呈正相关，与同一作物不同品种的耐盐性也呈正相关。 这与 5 种植物耐盐性鉴定的结果相一致，说明植物甜菜碱是植物体内抵御外界盐胁迫的渗透调节物质之一，其含量和变化与植物盐胁迫密切相关，可以作为植 耐盐性鉴定的生化指标。 盐胁迫下 5 种植物组织中的脯氨酸含量和变化 方差分析结果显示： 脯氨酸 含量在 5 种植物之间没有规律，与植物耐盐性的高低无关， 与材料的实际耐盐鉴定结果也不吻合。因此， 盐胁迫下植物组织中 脯氨酸含量不能作为植物耐盐性鉴定的生化指标，但可以作为一种盐胁迫的伤害指标，有一定的参考价值。 关键词 ：植物，耐盐性，甜菜碱，脯氨酸， of a of to s of it is to of to is of is an to of is to in of in of s a on of by to in to as a in a in o. 4; a in in in In in of by - B), 4of in of to in in of in of = of in of in T=of in o. 1 s It of in be a as or of in of in of of in be a it be a 录 摘 要 目 录 插图和附表 第一章 引 言 1 物耐盐研究的重要性 1 响植物耐盐性的因素 1 菜碱与植物的耐盐性 2 菜碱的理化性质 2 菜碱的代谢途径 2 菜碱的耐盐机理 4 氨酸 与植物的耐盐性 . 6 氨酸的理化性质 7 物中脯氨酸的代谢 7 脯氨酸的生理作用 8 究甜菜碱和脯氨酸的方法和进展 8 研究的目的和意义 10 第二章 材料与方法 11 料 11 法 11 验设计 11 胁迫处理 12 菜碱和脯氨酸的提取 13 菜碱和脯氨酸的检测 14 据的收集与分析 15 第三章 结果与分析 16 菜碱和脯氨酸检测方法的建立 16 果与数据分析 19 蓬 19 菜 23 麦 27 麦 32 豆 39 种植物方差分析结果 47 第四章 讨论 49 物的耐盐性鉴定 49 菜碱和脯氨酸检测 方法的建立 49 种植物组织中甜菜碱和脯氨酸 50 菜碱和脯氨酸的变化率 54 菜碱与植物的耐盐性 55 氨酸与植物的耐盐性 56 V 节 58 参考文献 59 附录：发表论文 A 1 利用水稻功能基因 记鉴定水稻种质资源 B 2 盐胁迫下植物组织中甜菜碱和脯氨酸的 析 G 3 盐胁迫下小麦组织中甜菜碱和脯氨酸含量的变化 O 致谢 Y 作者简历 1 插图 图 1 脯氨酸代谢 7 图 2 材料盐处理示意图 13 图 3 固相萃取仪和固相萃取柱 14 图 4 高效液相色谱和质谱联用 14 图 5 混合标样的 总离子流 色谱图 16 图 6 混合标样的总离子流色谱图 17 图 7 甜菜碱和脯氨酸混合标样的质谱图 17 图 8. 18 图 准曲线 18 图 10 盐处理 30 天碱蓬植株 19 图 11 盐胁迫下碱蓬叶和根中甘氨酸甜菜碱含量变化曲线图 20 图 12 盐胁迫下碱蓬叶和根中脯氨酸含量变 化曲线图 22 图 13 盐胁迫下甜菜叶和根中甘氨酸甜菜碱含量变化曲线图 24 图 14 盐胁迫下甜菜叶和根中脯氨酸含量变化曲线图 26 图 15 盐胁迫下大麦叶和根中甘氨酸甜菜碱含量变化曲线 28 16 盐胁迫下大麦叶和根中脯氨酸含量变化曲线 31 图 17 盐胁迫下小麦叶和根中甘氨酸甜菜碱含量变化曲线 34 图 18 盐胁迫下小麦叶和根中脯氨酸含量变 化曲线 37 图 19 300 迫下 3 种小麦组织中甘氨酸甜菜碱和脯氨酸变化曲线图 38 图 20 盐胁迫下大豆叶和根中葫芦巴碱含量变化曲线 40 图 21 盐胁迫下大豆叶和根中甘氨酸甜菜碱含量变化曲线 43 图 22 盐胁迫下大豆叶和根中脯氨酸含量变化曲线 46 2 附表 表 1 植物中甜菜碱的分布 3 表 2 主要甜菜碱 的名称和结构 4 表 3. 植物甜菜碱和脯氨酸检测方法 9 表 4 材料及特性 11 表 5 盐处理统计表 13 表 6 碱蓬耐盐鉴定结果 19 表 7 盐胁迫下碱蓬叶和根中甘氨酸甜菜碱结果数据 20 表 8 碱蓬叶中甜菜碱含量的方差分析结果 21 表 9 碱蓬根中甜菜碱含量的方差分析结果 21 表 10 盐胁迫下碱蓬叶和根中脯氨酸结果数据 22 表 11 碱蓬叶中脯氨酸含量的方差分析结果 23 表 12 碱蓬根中脯氨酸含量的方差分析结果 23 表 13 甜菜耐盐鉴定结果 23 表 14 盐胁迫下甜菜叶和根中甘氨酸甜菜碱结果数据 24 表 15 甜菜叶中甜菜碱含量的方差分析结果 25 表 16 甜菜根中甜菜碱含量的方差分析结果 25 表 17 盐胁迫下甜菜叶和根中脯氨酸结果数据 25 表 18 甜菜叶中脯氨酸含量的方差分析结果 26 表 19 甜菜根中脯氨酸含量的方差分析结果 27 表 20 大麦耐盐鉴定结果 27 21 盐胁迫下大麦叶和根中甘氨酸甜菜碱含量 28 表 22 大麦叶甜菜碱含量的方差分析结果 29 表 23 大麦根甜菜碱含量的方差分析结果 29 表 24 盐胁迫下大麦叶和根中脯氨酸的含量 30 表 25 大麦叶脯氨酸含量的方差分析结果 31 表 26 大麦根脯氨酸含量的方差分析结果 32 表 27 小麦耐盐鉴定结果 32 表 28 盐胁迫下小麦叶和根中甘氨酸甜菜碱含量 33 表 29 小麦叶中甜菜碱含量方差分析结果 35 表 30 小麦根中甜菜碱含量方差分析结果 35 表 31 盐胁迫下小麦叶和根中脯氨酸含量 36 表 32 小麦叶脯氨酸含量的方差分析结果 37 表 33 小麦根根中脯氨酸含量方差分析结果 38 表 34 大豆耐盐鉴定结果 39 表 35 盐胁迫下大豆叶和根中葫芦巴碱含量 40 表 36 大豆叶葫芦巴碱含量的方差分析结果 41 表 37 大豆根葫芦巴碱含量的方差分析结果 41 表 38 盐胁迫下大豆叶和根中甘氨酸甜菜碱含量 42 表 39 大豆叶甘氨酸甜菜碱含量的方差分析结果 43 表 40 大豆根甜菜碱含量的方差分析结果 44 表 41 大豆叶葫芦巴碱和甘氨酸甜菜碱含量的方差分析结果 45 表 42 大豆根葫芦巴碱和甘氨酸甜菜碱含量的方差分析结果 45 表 43 盐胁迫下大豆叶和根中脯氨酸含量 46 表 44 大豆叶脯氨酸含量的方差分析结果 46 表 45 大豆根脯氨酸含量的方差分析结果 47 表 46 9种试材叶中甜菜碱含量方差分析结果 47 表 47 9 种试材根中甜菜碱含量方差分析结果 47 表 48 9 种试材叶中脯氨酸含量方差分析结果 48 表 49 9 种试材根中脯氨酸含量方差分析结果 50 9 种植物耐盐性鉴定结果 49 表 51 盐胁迫下 甜菜碱和脯氨酸的变化率 55 表 52 5 种植物盐胁迫下甜菜碱的最高含量和对照中的含量 56 第一章 引 言 物耐盐研究的重要性 土壤盐渍化是一个 全球 性的资源问题和生态问题 ，成为 限制世界和我国农业生产的主要因素之一。据联合国粮农组织 (000 年统计，世界盐渍化土壤面积为 平方公里（不包括不合理灌溉造成的次生盐渍化面积），占世界土壤总面积的 3%。其中欧洲盐渍化土壤面积 平方公里，美洲盐渍化土壤面积 平方公里，北亚和乌拉尔东部地区盐渍化土壤面积 非中东地区盐渍化土壤面积 平方公里，撒哈拉以南非洲地区盐渍化土壤面积 平方公里，亚太地区盐渍化土壤面积 平方公里。中国盐渍化土壤面积 平方公里，占中国土壤总面积的 8%。因此，在耕地有限、人口不断增长的今天，开发和有效利用盐渍化土壤具有重要的现实意义 (赵可夫 1993；赵可夫和李法曾 1999； 翁跃进 2002)。 盐渍化土壤开发利用有两条途径：一是改良环境适应作物，即用传统水 土工程改良盐渍土壤；二是培育适应逆境的品种。实践证明，第一条途径人力、物力、财力消耗巨大，成本昂贵，并耗费大量淡水资源，由于淡水资源匮乏，因而受到很大限制。相比较，耐盐品种的选育和基因工程成为更加经济和有效的途径。尽管育种家们培育了一些耐盐作物品种，也创造了一些转基因耐盐品种，但是耐盐品种还很少，特别是可推广应用的耐盐品种十分有限，其原因之一是对作物乃至植物的耐盐机理研究的不够。在了解大量的现有植物（耐盐和不耐盐）的生化机理和基因调控的机理，才可能高效地培育出更多的耐盐品种。因此，揭示植物耐盐机理的研究成为 农业种质资源鉴定、耐盐品种选育和耐盐基因克隆的基础。 响植物耐盐性的因素 植物对盐渍生境的适应主要通过肉质化、渗透调节、离子区域化、从气孔分泌盐分以及对盐中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 2 离子强烈的选择性吸收等作用来实现的。其中渗透调节是主要因素。所谓渗透调节，是指植物生长在渗透胁迫下其细胞中在渗透上有活性和无毒害作用的溶质主动净增长，使得细胞浓度增大，渗透势降低，使其在低渗透势生境中仍能吸收水分，保证植物正常生长发育。植物渗透调节的方式有两种：一是在细胞中吸收和积累无机盐；二是在细胞中合成有机溶质。植物在细胞中积累一定数量的可溶 性有机物，作为渗透调节剂共同进行渗透调节，以适应外界的低水势。植物在盐胁迫下合成的有机物的种类和数量随植物种类不同而异。合成的有机物质大体上可以分成以下几类：（ 1）氨基酸类；（ 2）生物碱类；（ 3）有机酸类；（ 4）可溶性碳水化合物；（ 5）糖醇类。现在研究发现甜菜碱和脯氨酸是植物渗透调节中主要积累的溶质，参与胁迫下植物体内细胞代谢，在植物的耐盐性上发挥了重要的作用。因此，对于甜菜碱 (赵可夫 1993， 2002；可夫和李法曾 1999；张海燕等 1998；赵利辉等 2001； et 1996； et et et 1982； et 1998； et 1990； et 1987； et 1999； et 1999； er 1997； et 1994； et 1992； et 1986, 1995； et et et 1986； et 1987； 983, 1991) 和脯氨酸（ 傅秀云 等 1998； 杨凯等 2001；赵锁劳等 1998； 981；et 1993； et 1996； et 1986； et et 1981； et 1996； et 1997； et 1996）与植物的耐盐性研究成为植物耐盐机理研究的“热点”和重点。 甜菜碱与植物的耐盐性 甜菜碱 (一种 无毒性的细胞相容性物质，广泛存在于植物、海洋无脊椎动物、真菌、细菌中。在医疗卫生方面，甜菜碱具有抗肿瘤、降血脂与保肝、降压、治疗胃酸缺乏及动脉硬化等功能；在饲养业它 广泛应用于 畜牧 、 禽兽 、水产养殖的诱食促长的营养型添加剂 ，具有 高效、优质、经济 等特性；在化妆品、食品上也有一定的应用。 耐盐的非盐生植物在叶中积累小分子的有机物质如 氨基酸类、生物碱类、有机酸类、可溶性碳水化合物、糖醇类等来调节它们的耐盐性是十分重要的生理现象。在渗透胁迫条件下，甜菜碱是高等植物中最重要积累的代谢产物之一，对植物的耐盐性上具有重要的调节作用，与植物耐盐性密切相关。甜菜碱参与细胞的渗透调节作用、稳定生物大分子的结构与功能、影响离子在细胞内的分布等。因此 , 对甜菜碱与植物的耐盐性的研究具有重要的理论价值和实际意义。 植物中不同的科属种中甜菜碱的种类不同（表 1） (et 1993)。 菜碱的理化性质 甜菜碱是一类 季铵化合物， 化学名称为 式为 N X。植物中的甜菜碱主要有 12 种 (表 2) (梁峥等 1995； 990； et 1975， 1977)。 1883 年， 次从中宁枸杞 (分离得到甘氨酸甜菜碱 (简称甜菜碱），称之为 的化学名为三甲胺乙内酯、三甲胺乙内酯盐酸盐，甘氨酸甜菜碱通常以盐酸盐形式存在，它的结构式如下： 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 3 两者的分子式分别为 子量分别为： 观均为无色柱状晶体；熔点为： 293 (分解 )；溶解度分别为 160g/100 55g/10000 菜碱的代谢途径 植物中的甜菜碱生物合成途径比较简单，胆碱单氧化酶 (甜菜碱醛脱氢酶 (甘氨酸甜菜碱合成仅需要的两种酶。 碱 甜菜碱合成途径中的一个酶，最适 为 应需要 子激活，分子量 约 98 (1994)从一种土壤细菌中克隆出了胆碱氧化酶基因 在花榔菜花叶病毒的 35S 启动子的控制下将 因转移到拟南芥中，转基因后的植株可积累甘氨酸甜菜碱，耐盐性显著提高 (刘凤华等 1997；郭北海等 2000； et 1994)。 植物甜菜 碱合成的关键性酶，是一个 60肽二聚体，主要活性位于叶绿体基质中，该酶的等电点为 ，酶活性几乎不受影响。在渗透胁迫下 活力成倍地增加。 1989年 功地体外合成了 证明在盐胁迫下 加 4 倍。随后又从菠菜和甜菜中克隆到 较了二者的同源性 (肖岗等 1995； 郭房庆 等 1999； 侯彩霞 等 1999； 郭北海 等 2000； 刘强 等 2000； 江行玉 等 2001； 李孟军 等 2002；马长乐 等 2002)。 表 1 植物中甜菜碱的分布 (et 1993) of of et 1993) 甜菜碱 科 积累的种 不积累的种 氨酸甜菜碱 藜科 科 榄雌科 本科 科 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 4 旋花科 花丹科 茄科 科 白花丹科 氨酸甜菜碱 菊科 科 形科 脯氨酸甜菜碱 菊科 科 形科 金娘科 啶甜菜碱 菊科 科 2 主要甜菜碱的名称和结构 (梁峥等 1995 ) et 995) 名 称 结 构 名 称 结 构 甘氨酸甜菜碱 （ ( 26（ 2脯氨酸甜菜碱 (（ -） 4(-)4（ +） 4(+)4(3- 组氨酸甜菜碱 (色氨酸甜菜碱 (2(2哌可酸甜菜碱 (中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 5 葫芦巴碱 (菜碱的耐盐机理 甜菜碱与植物的耐盐性表现在以下几个方面：在盐胁迫下甜菜碱可以作为渗透调节剂调节细胞内的渗透压，使植物适应外界的低水势 (张海燕等 1998；侯彩霞等 1999； et 1997； et 1982； et 1983； et 1998； et 1986)；在盐胁迫下甜菜碱可以影响植物体内离子的分布，稳定胁迫下植物体内的大分子，调节植物对盐胁迫环境的适应（ 邱念伟等； 2001et 1987； et 1983； et 1992； et 1992； et 1987）；甜菜碱与植物耐盐性相关的最直接的证据是体外喷施甜菜碱可以 增强植物的抗逆性（ 许霞等 2001； et 1987； et 1996； et 1997； et 1997； et 1998； et 1998）。 甜菜碱参与细胞渗透调节作用 在胁迫下甜菜碱可以作为渗透调节剂来调节植物适应环境，在植物体的不同部位积累与分配。正常生长的植物体中，甜菜碱的含量并不高，并且存在种间与组织间含量的差异。甜菜碱在叶绿体中合成，主要分布在叶绿体及细胞质 中，这符合溶质区域化理论。甜菜碱只有区域化地分布在占细胞体积很小的细胞质中，在渗透胁迫条件下，其积累的浓度才有可能起主要的渗透调节作用 (侯彩霞等 1999)。 (1982)在研究藜科植物的耐盐性时发现甜菜可以在茎叶和根中积累大量的甜菜碱， 5 个甜菜品种在 150理 6 周后，茎叶和根都有 2的甜菜碱积累，并没有大幅度的降低甜菜的产量。 在植物长期处于盐胁迫或缺水时，植物叶片中的溶质势和甜菜碱水平有近似线性关系，这在甘氨酸甜菜碱得到证实，而且也适用于 氨酸甜菜碱。积累 是由于在叶子生长中加强了甜菜碱的合成，分解速度减慢。在受到胁迫的叶子中甜菜碱的高合成速度伴随着胆碱合成速度增大。胆碱氧化成了甜菜碱，胆碱单加氧酶（ 甜菜碱醛脱氢酶（ 盐胁迫下的叶片中催化效率很高。大麦施加 少了脯氨酸，但没减少甜菜碱的积累，说明积累甜菜碱的生物信号与积累脯氨酸的不同。甜菜碱在不同的植物及植物的不同器官含量不同，正常条件下许多耐盐植物的茎叶中含有 10甜菜碱，在根中有 3uM/盐的非盐生植物茎叶中含有 1-5 uM/甜菜碱，根中大 约含 0.5 uM/盐敏感品种中含量很少或没有发现甜菜碱。大部分耐盐植物当在盐胁迫下都有甜菜碱的积累。甜菜碱调节作用的间接证据是，在高电解质下甜菜碱在植物体及各个组织都增加了。当 加时甜菜碱增加很少，而且在低浓度 盐生植物体内高甜菜碱，这些说明这种溶质可以在细胞质和液泡之间转移分配，这要依赖于组织中总电解质的浓度。在高盐浓度下甜菜碱的浓度在耐盐草类如野大麦中会增加到16 uM/盐胁迫植株转入无 培养液中时，脯氨酸迅速减少而甜菜碱保持不变 (张海中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 6 燕等 1998； et 1983； et 1986； et 1998)。 藜科植物的组织化学、生物化学、植物生理方面的证据表明甜菜碱是藜科植物内部的无害的细胞质渗透调节物，可以帮助细胞质和液泡之间的渗透平衡 (et 1997)。 菜碱影响离子在细胞中的分布，稳定生物大分子的结构 在盐胁迫下甜菜碱与 吸收、细胞溶质、细胞膜及酶有一定的联系 (邱念伟 等 2001；et 1992)。 (1987)在 研究离体大麦根 动力吸收时，与提前用甘氨酸甜菜碱处理过的大麦根作了比较。细胞内部甜菜碱的增加促进了 吸收，这种结果与内部甜菜碱或 关或两者的结合作用。 收的半稳定状态存在于液泡膜上而不是质膜上，这种现象可能是由于施加了甘氨酸甜菜碱，大麦根中的液泡膜流动和液泡中 浓度要高于不施的，这样甜菜碱的膜调节功能与离子的区域化被提了出来。 甜菜碱是一种在水分或其它环境条件胁迫下积累的一种细胞溶质，可以稳定酶和细胞膜(et 1987)。对植物体外施甜菜碱是一种增强 代谢积累这种溶质的方法。 (1992)在研究红甜菜根时发现施加 10氨酸甜菜碱到高渗透的介质中，甜菜碱可以削弱介质对细胞 9